He estado midiendo las concentraciones de mis soluciones de proteínas diluyéndolas en agua 20 veces con un volumen final de 100 uL y luego midiendo las absorbancias de estas soluciones en placas de 96 pocillos con lector de placas. No recuerdo haber tenido ningún problema hasta hoy.
Usé tampón de fosfato 20 mM en lugar de agua para diluirlos hoy y medí las absorbancias a 280 nm repetidamente tres veces y la absorbancia de una de las soluciones aumentó de 0,043 a 0,068 (la absorbancia del tampón de fosfato 20 mM es 0,030 a 280 nM con mismo volumen); Dejé de medir después del tercero, pero probablemente aumentaría a medida que medí hasta llegar a una meseta.
Medí las absorbancias de dos proteínas y solo una de ellas subió tanto, la otra subió de 0.071 a 0.088; si esto fuera a depender de la concentración, esperaría que la segunda solución fuera aún más alta, pero no sucedió.
Sé que puede haber diferencias en las absorbancias UV si la proteína se pliega o se despliega; seria tan dramatico? ¿A qué se debe ese aumento? Agradeceré una explicación y una solución práctica al problema.
NOTA: Aumenté el volumen total a 200 uL simplemente agregando 100 uL de tampón de fosfato 20 mM en todos los pozos y el aumento de la señal se desaceleró mucho; aunque todavía hay algún aumento con incrementos de 0.001-0.003 en cada medición.
Parece que sus concentraciones de proteína están justo en el límite de detección del espectrofotómetro, y cambiar el tampón diluyente cambió sus concentraciones. Es posible que las muestras no se hayan mezclado completamente después de la dilución y antes de la medición, por lo que las mediciones variables pueden ser simplemente la solución que llega al equilibrio. La temperatura también puede afectar la absorbancia, por lo que debe verificar que sus muestras se hayan equilibrado antes de sacar conclusiones. Si la absorbancia de su tampón de fosfato es 0,03, intentaría mantener las absorbancias de la muestra por encima de 0,075 o más para evitar acercarse demasiado al límite de detección. Además, asegúrese de que su tampón no sea demasiado viejo o esté contaminado con algo que pueda estar afectando sus características de absorbencia.
Sugeriría tomar una o dos muestras de proteínas y hacer una serie de diluciones (1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20) en un volumen grande (digamos 400 ul cada uno, si puede ahorrarlo), Agitar brevemente para mezclar bien, luego medir triplicados de cada dilución en su lector, junto con los espacios en blanco apropiados (solo tampón). Verá diferencias entre cada medida, pero debería ser bastante pequeña, dependiendo de la exactitud y precisión de su instrumento.
Los valores medidos no serán exactamente los mismos de una medición a otra, y se necesitarían muchas más de tres repeticiones para determinar si se está produciendo una tendencia de deriva real. Mida su placa de muestra cada 5 minutos durante una hora y registre los valores (no los mire a simple vista) para ver si es posible que la máquina necesite servicio.
Podría ser el desdoblamiento de proteínas o cambios en la conformación. La absorbancia a 280 nm se debe principalmente a los residuos de triptófano y puede cambiar sustancialmente a medida que estos residuos pasan de un entorno más hidrofóbico (enterrado dentro de la proteína) a uno más hidrofílico (expuesto al solvente). Su proteína puede estar reaccionando al nuevo tampón.
alan boyd
Engin Yapicí
MattDMo
Engin Yapicí