Recientemente me encontré con un problema después de la tripsinización de mis células CHO transfectadas de manera estable. Cuando añado medio para enjuagar las células del fondo del matraz, normalmente hay grandes trozos de células, que casi no puedo resuspender correctamente... También traté de aumentar el tiempo de incubación con tripsina, pero no sirvió de mucho. .
¿Alguien tiene una solución para esto? La tripsina que uso es el mismo lote que de costumbre y mientras tanto también he descongelado 2 stocks de congelación diferentes, pero sigo teniendo el mismo problema.
También probé diferentes pipetas, de 25 a 5mL. Pero puedo pipetear como un maníaco arriba y abajo y arriba y abajo... todavía hay grandes trozos de células flotando...
Gibco tiene un agente antiaglomerante verificado para células CHO, al igual que Lonza, pero me gustan más los reactivos de Gibco. Las células tienden a agruparse por varias razones, incluido el ADN extracelular de las células lisadas y la presencia de iones Ca y Mg (iones importantes para la adhesión y agregación celular).
Podrías probar estos:
1) Lavar y resuspender en solución salina balanceada sin magnesio ni calcio. Como la solución salina equilibrada de Hank.
o
2) Tratar con DNasa I. Creo que podría bajar hasta 1 UI/ml durante 30 minutos a 1 hora para acabar con una buena cantidad de aglomeraciones de ADN. Puede hacerlo en un medio basal (como RPMI, DMEM, etc.) o en la solución salina balanceada. Su medio puede contener suero solo si el suero ha sido inactivado por calor como proteasas en el suero para inactivar su ADNasa. Incube con DNase bajo agitación suave a 37 °C (siempre tuve un rotador de tubos en una incubadora para este propósito, solo coloque sus células en un recipiente cónico de 50 ml y ajústelos para que se agiten durante 1 hora. También puede usar una unidad agitadora calentada). Si no tiene esta configuración, puede agitar a temperatura ambiente, pero tal vez por un poco más de tiempo.
y tal vez
3) Una de las otras opciones obvias es evitar pasar las células agrupadas y recolectar el resto. Puede hacer esto poniendo todas sus células en un matraz incl. los grumos, agítelos por un momento y déjelos reposar para que los pedazos caigan rápidamente al fondo y recolecten todo menos las cosas que cayeron al fondo.