En los protocolos de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), a menudo veo instrucciones para desgasificar la solución de gel poniéndola al vacío durante 10 a 15 minutos antes de polimerizar el gel.
Normalmente no hago esto, y cuando lo probé una vez no pude ver ninguna diferencia. Entonces, me pregunto qué se pretende lograr exactamente con la desgasificación y qué tan grande debería ser el efecto.
Cualquier literatura que examine el efecto de la desgasificación sería apreciada.
La razón para desgasificar sus geles es eliminar el oxígeno. El oxígeno en el gel interfiere con la polimerización, ralentizándola y haciéndola menos consistente, por lo que la desgasificación la hace más rápida y uniforme.
Desde el protocolo EncorBio SDS-PAGE :
La polimerización es más rápida y uniforme si se desgasifican las tres primeras soluciones durante unos minutos en un matraz Ehrlenmeyer al vacío doméstico antes de añadir los últimos tres reactivos. El oxígeno molecular inhibe la polimerización al reaccionar con los radicales libres SO 4 - iones, razón por la cual los geles PAGE se vierten en tubos o entre placas y no en aparatos horizontales abiertos, como se puede hacer con la agarosa. También es una buena idea colocar una capa de isopropanol sobre el gel, ya que esto evita que entre oxígeno e inhiba la polimerización.
El oxígeno también puede conducir a la oxidación de productos proteicos, lo que podría ser crucial si luego desea extraer los productos y utilizarlos para otra cosa (por ejemplo , Sun & Anderson, 2004 ).
Finalmente, tener burbujas en su gel puede distorsionar los resultados y hacerlos menos reproducibles, ya que las burbujas no se formarán consistentemente con cada repetición y alteran el medio físico de la poliacrilamida. Entonces, otro propósito de la desgasificación es garantizar la repetibilidad.
La hoja de información de polimerización de acrilamida de Bio-Rad tiene la mejor información que pude encontrar:
La formación de geles de poliacrilamida procede mediante polimerización por radicales libres. Por lo tanto, la reacción es inhibida por cualquier elemento o compuesto que sirva como trampa de radicales libres (Chrambach 1985). El oxígeno es un inhibidor de este tipo. El oxígeno, presente en el aire, disuelto en soluciones de gel o adsorbido en las superficies de plástico, caucho, etc., inhibirá y, en casos extremos, impedirá la polimerización de acrilamida. La desgasificación adecuada es fundamental para la reproducibilidad. Por lo tanto, uno de los pasos más importantes en la preparación de geles de poliacrilamida es la evacuación o “desgasificación” de las soluciones de gel inmediatamente antes de verter el gel. Esto se hace colocando el matraz de solución de gel en una cámara de vacío o bajo un aspirador potente. En algunos casos, puede ser necesaria una bomba de vacío.
Las soluciones de reserva de tampón y las soluciones de reserva de monómero generalmente se almacenan a 4 °C. Las soluciones frías tienen una mayor capacidad de oxígeno disuelto. El proceso de desgasificación es más rápido y completo si la solución de gel se lleva a temperatura ambiente (23–25 °C)‚ antes de que comience la desgasificación. Además, si una solución de gel frío se coloca al vacío, el proceso de evacuación tiende a mantener la solución fría. Verter un gel con una solución fría tendrá un efecto negativo sustancial en la tasa de polimerización y en la calidad del gel resultante.
La polimerización en la que se usa riboflavina como uno de los iniciadores requiere desgasificación. La conversión de riboflavina de la forma flavo a leuco (la especie activa en la iniciación) en realidad requiere una pequeña cantidad de oxígeno (Gordon 1973).
Esto explica por qué la polimerización iniciada principalmente por la riboflavina puede bloquearse completamente mediante una desgasificación exhaustiva. Sin embargo, el exceso de oxígeno del necesario para convertir la riboflavina en la forma activa inhibirá el alargamiento de la cadena del polímero, como ocurre en las reacciones iniciadas únicamente por persulfato de amonio y TEMED. Por lo tanto, aunque la desgasificación sigue siendo importante para limitar la inhibición, no debe ser tan extensa como para evitar la conversión de riboflavina a la forma activa. Para la polimerización iniciada por sistemas de riboflavina/TEMED o riboflavina/TEMED/persulfato de amonio, la desgasificación no debe exceder los 5 min.
Una consecuencia de la interacción de la riboflavina con el oxígeno es que la riboflavina parece actuar como un eliminador de oxígeno. Esto está respaldado por la observación de que la adición de riboflavina (5 µg/ml) a las soluciones de gel de apilamiento que contienen persulfato de amonio/iniciadores TEMED da como resultado una polimerización más limpia y uniforme en las superficies del gel expuestas al oxígeno (como los peines). Es probable que se logre el mismo efecto mediante una desgasificación más completa de las soluciones sin riboflavina.
Ya sea que se utilicen iniciadores de polimerización química (persulfato de amonio/TEMED) o fotoquímica (riboflavina/TEMED o riboflavina/TEMED/persulfato de amonio), la calidad reproducible del gel y las características de separación requieren una cuidadosa atención a la temperatura de la solución de gel antes de la desgasificación y al tiempo, la temperatura y la temperatura de la desgasificación. y vacío. Estos parámetros deben mantenerse constantes cada vez que se preparan los geles.
Perdón por las citas largas, pero se pegan aquí en caso de que desaparezcan las fuentes originales.
Referencias:
He estado utilizando geles con diferentes proporciones de acrilamida/bisacrilamida recientemente. Las personas generalmente trabajan con proporciones de 1:37.5, 1:29 que se usan comúnmente para geles de ADN y proteínas. He notado que cuando trabajas con ratios inferiores a 1:200 - 1:500, la desgasificación se vuelve fundamental para garantizar una resolución reproducible de mis proteínas. Si no desgasifico la mezcla en uno de estos geles, algunas de las proteínas que estoy resolviendo (que migran muy cerca unas de otras) no se separarán lo suficientemente bien. Además, el tiempo que tarda en polimerizar el gel puede pasar de 20 a unos 45 minutos si no desgasifico la solución antes. Las soluciones de desgasificación con proporciones normales de reticulante de 1:29, 1:37,5, según mi experiencia, no parecen tener mucho efecto además de tener tiempos de polimerización más rápidos. Quizás marque la diferencia con geles de menor concentración (8-5%),
usuario560