La pregunta es bastante simple: ¿la fijación de formaldehído o metanol en la preparación para la tinción inmunocitoquímica/inmunofluorescente afecta el pH de los lisosomas?
Algunos antecedentes: estoy tratando de observar el tráfico intracelular de una enzima lisosomal marcada con fluorescencia. Las células se cultivan in vitro y se tratan con la proteína marcada, que se incorpora a las células mediante endocitosis mediada por receptor . El complejo proteína-receptor se dirige a la vía endosoma-lisosoma tardía, donde eventualmente el pH ácido del lisosoma hace que los dos se disocien y el receptor se recicle, mientras que la enzima permanece y hace su trabajo. He etiquetado la enzima con dos tintes diferentes: Alexa Fluor 488, que supuestamente es insensible al pH entre 4 y 10 , y pHrodo Red, que tiene una fluorescencia mucho mayor a medida que desciende el pH. Alexa488 es el más brillante de los tintes de Alexa y se usa ampliamente en todo tipo de aplicaciones. pHrodo no es tan brillante (por lo que sé, ha sido difícil encontrar comparaciones), pero su dependencia del pH ayuda a reducir el efecto de la unión extracelular no específica, y hasta ahora parece funcionar en mi sistema.
¿Entonces, cuál es el problema? Estoy desarrollando un ensayo que medirá la capacidad de ciertas sustancias para bloquear la absorción de esta enzima en la célula. Dado que mediré la falta de señal, cuanto más alta pueda obtener la señal desinhibida, mejor. Como dije, pHrodo funciona bien, pero podría ser mejor. El problema es que mi proteína marcada con Alexa tiene una relación señal/ruido extremadamente baja, cuando hubiera esperado exactamente lo contrario. Me pregunto si, en mi sistema, el colorante Alexa es realmente algo sensible al pH y no emite fluorescencia cuando está en el lisosoma ácido. También estoy encontrando algunos otros problemas, y mientras antes estaba realizando imágenes de células vivas, estoy empezando a jugar con la idea de arreglar las células primero,
De ahí mi pregunta: ¿La fijación de las células con formaldehído al 4% en PBS (protocolo ICC/IF estándar) afectará el pH de los lisosomas? ¿La fijación de metanol haría lo mismo? ¿Alguna otra sugerencia para aumentar la señal?
En mi opinión, la fijación celular no debería cambiar el pH. Sin embargo, la formalina sin amortiguar se oxidará y reducirá el pH, pero el uso de PBS debería amortiguar alrededor de pH 7. Tal vez la fijación con glutaraldehído también sería una opción, si las otras no funcionan...
Encontré este sitio web de leica muy útil, tal vez también te ayude:
Sí, ambos afectarán el pH.
Además del comentario anterior, ambos, pero el metanol deshidrata especialmente las muestras: la eliminación del agua definitivamente afectará el pH en los orgánulos. Esto dependerá del tiempo. Tanto la duración de la fijación como el tiempo después de la fijación antes de evaluar las células afectarán el pH de los orgánulos.
Debido a que arregla las células en un entorno no acuoso (supongo que está usando la fijación estándar), no usa el búfer durante la fijación. Es posible que podamos responder mejor si publica el protocolo general que sigue.
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usuario4739