En respuesta a mi pregunta anterior , he estado leyendo un poco sobre poli - D -lisina, colágeno I, colágeno IV, laminina y otros recubrimientos de cultivo de tejidos que promueven la adhesión celular. Siempre supuse que cualquier cosa que no sea plástico o vidrio estándar tratado con TC aumentaría significativamente el fondo, pero tal vez mis puntos de vista sobre la fluorescencia de fondo estén un poco desactualizados. ¿Alguien tiene experiencia con estos en un entorno de microscopía fluorescente/detección de alto rendimiento?
Específicamente en mi caso, estoy analizando la endocitosis y el tráfico de una proteína marcada hacia el lisosoma . Estoy marcando la proteína con el colorante dependiente del pH pHrodo TM de Molecular Probes, que supuestamente tiene muy poca fluorescencia a pH neutro, pero se vuelve muy brillante a medida que el pH cae cuando las vesículas endocíticas se convierten en lisosomas. En teoría, esto significa que no se necesita un paso de lavado final, pero con un revestimiento de matriz en las placas, me preocupa el fondo.
Entonces, ¿cuál es el pensamiento actual en lo que respecta a la fluorescencia de fondo de las diversas matrices TC? ¿El fondo proviene de la propia matriz o del colorante fluorescente que se adsorbe en ella? ¿Es dependiente de la longitud de onda? Afortunadamente, es posible que no me quede atrapado con mis células que se adhieren mal, y es posible que al final no necesite matriz suplementaria, pero aún quiero comprender mejor cómo funciona.
La matriz extracelular (MEC) emite fluorescencia, especialmente el colágeno y la laminina. El máximo está en los canales DAPI y FITC y la fluorescencia se vuelve más débil hacia longitudes de onda más largas. Sin embargo, dado que la capa de los matraces TC es muy delgada, no esperaría que esto sea un problema. Lo mejor es probarlo. También hay disponible un documento bastante famoso que podría ser de ayuda: