Encontrar una combinación de plantilla/oligo para mi primer experimento de PCR

Soy ingeniero en tecnologías de la información. Me encanta la biología, así que investigo temas biológicos y me interesa la PCR. Por eso he decidido crear una máquina PCR.

Ya está todo hecho y quiero hacer mi primer experimento para ver si funciona o no. Sería muy feliz si alguien pudiera darme alguna sugerencia para probarlo en casa. ¿Qué oligo debo usar para probar de la manera más fácil? Me refiero a una plantilla de ADN para pruebas que sea fácil de encontrar y extraer.

Respuestas (3)

Necesita un genoma que no sea demasiado complejo, lo que sugiere algo microbiano. También necesita un genoma que esté bien caracterizado: ya sea completamente secuenciado o con muchos genes secuenciados que le permitan diseñar cebadores. Y finalmente, necesita una fuente de material de fácil acceso para la extracción de ADN.

Sugeriría levadura seca, como fuente de ADN de Saccharomyces cerevisiae , o yogur vivo como fuente de ADN de Lactobacilli. Incluso podría intentar cultivar algo a partir de yogur para obtener colonias bacterianas puras: dado que estas serían de una fuente de alimentos, debería haber un riesgo mínimo.

Puede sentirse tentado por una de las fuentes vegetales tradicionales de ADN (por ejemplo, cebollas), pero puede ser complicado evitar la copurificación de polisacáridos que inhiben las enzimas relacionadas con el ADN.

Finalmente, si cultiva algunas bacterias, o incluso si usa levadura seca, probablemente no necesite preparar ADN en absoluto. La PCR directa de células bacterianas se usa ampliamente: el paso de 95 C liberará suficiente ADN.

agregado más tarde en respuesta al comentario de OP

Elegí hacer un seguimiento de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus porque encontré esto una y otra vez con referencia al yogur. Si tuviera que probar una variedad de yogures, creo que podría estar bastante seguro de que esto estaría presente.

Hay 5 genomas publicados para diferentes cepas de la especie Lactobacillus delbrueckii , incluidas las subespecies bulgaricus (varias cepas) y lactis . ¿Qué tan diferentes son? Decidí mirar un gen, y la lactato deshidrogenasa parecía una opción lógica (produce el ácido láctico).

La secuencia de nucleótidos completa para el gen de la lactato deshidrogenasa de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842 está aquí . Si ejecuta un BLAST desde esa página que limita la búsqueda a Lactobacilli (taxid 1578), de hecho encontrará resultados en el gen de varios otros genomas. Aquí hay una selección representativa desde la alineación de la secuencia hasta el menos similar de los resultados:

Query  99766   CCTTCCACGCTTCTGGAGGTACTGAATTCGCCCTGGCTCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  99825
               ||||||||||||||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||
Sbjct  90616   CCTTCCACGCTTCTGAAGGTACTGAATTCGCCCTGGCCCAACTGGGCAACGATGCCGGTA  90675

Query  99826   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATGTAAAAAAGCACCAGGCTTTTAA  99885
               ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||| |||||||
Sbjct  90676   TGTACGGTGCCGTTAAGATGGTTCTGTAATTTTGAATATAAAAAAGCACCAGACTTTTAA  90735

Query  99886   AGTCTGGTGCtttttttGTTTATCCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTTATCGTCGCGGCTG  99945
               |||||||||||| |||||||||| |||||||||||||||||||||| |||||||||||||
Sbjct  90736   AGTCTGGTGCTTATTTTGTTTATTCTAAAGAGTCCAGGGTTGCCTTCATCGTCGCGGCTG  90795

Query  99946   AGGCCCGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGTACGTGGCTGATCC  100005
               ||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| |
Sbjct  90796   AGGCCTGCATCTTGGCCAATTCGCTGTCATTTAACGGCAATTCCAGCACGTGGCTGATTC  90855

Query  100006  CTTGTCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGGTAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  100065
               |||| |||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  90856   CTTGCCCGTTGATGATGGCCAGGGTGCCCAGATAGATCTCATCCTTGATCCCGTATTCCC  90915

Query  100066  CGTGCAATGGTGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGTCACGA  100125
               |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||
Sbjct  90916   CGTGCAATGGCGCGGAAAGAGGCAGGGCCAGGTCGTTGTTTTCCAAAATGGCCGCCACGA  90975

Query  100126  TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTTGCGCCCTTTTTGACGATAATCTCGC  100185
               |||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||| |||| |||||||
Sbjct  90976   TCTTGGCCAGCATCATGGCCACGCCATAGTAGGTCGCGCCCTTTTTGCCGATGATCTCGC  91035

Como puede ver, hay algunas diferencias, pero no debería haber problemas para diseñar cebadores que coincidan con ambos (nuevamente, esto es solo una parte del gen). Obviamente, es posible que desee realizar una alineación para las 5 secuencias, pero tuve la impresión de que al menos algunas de las otras eran idénticas a la consulta, aunque son de diferentes subespecies. Estos son organismos muy estrechamente relacionados.

En términos de su experimento, le sugiero que planee usar una variedad de yogures y/o entrantes como fuente de plantilla. Incluso podría mezclarlos, si hay limitaciones en su configuración.

Hola, muchas gracias. El yogur vivo es una buena idea. Entonces, ¿necesito cultivar lactobacilos a partir de yogur para obtener colonias bacterianas puras antes de la PCR o solo necesito PCR directamente a partir de yogur vivo?
Me preocuparía que algo en el yogur pudiera inhibir la PCR. ¿Tienes una centrífuga? Tal vez intente diluir un poco de yogur y luego hacer girar un sedimento celular. Esto parece el punto de partida .
O puede comprar un cultivo iniciador de yogur, podría ser más limpio.
No estoy seguro de que lo que compro sea exactamente el mismo tipo de Lactobacilli porque el vendedor no conoce el nombre científico de la bacteria. Hay docenas de tipos de Lactobacilli, así que me preocupa que deba diseñar muchos cebadores.
"¿Tienes una centrífuga? Tal vez intente diluir un poco de yogur y luego hacer girar un sedimento celular". ¿Puedes describir más sobre este método? Nunca he usado una centrífuga antes, pero puedo crear una. ¿Cómo sé dónde se encuentran las bacterias en el tubo después de la centrífuga (¿suele estar en la parte inferior?) y cómo calcular las RPM adecuadas?
@Đức UltraSoft Probablemente sea mejor hacer una nueva pregunta en este punto.

Buen proyecto. ¿ Cómo se compara su máquina con este termociclador de código abierto ?

Dado que probablemente esté solicitando un par de oligonucleótidos de ADN (cebadores), yo pediría un par de oligonucleótidos de ADN más que funcionarán como su plantilla.

Algo como esto:

oligo 1, primer forward. 5'-AAAAAAAAAAA-3'->
oligo 2, template        3'-TTTTTTTTTTTNNNNNNN[...]NNNNNNNNNNCCCCCCCCCC-5'
oligo 3, template        5'-AAAAAAAAAAANNNNNNN[...]NNNNNNNNNNGGGGGGGGGG-3'
oligo 4, primer reverse                                <--3'-CCCCCCCCCC-5'

Esto es solo para darle una idea, las secuencias reales deberían ser más largas, tener un contenido de GC% similar y una fusión similar. La ventaja es que reduce la complejidad y prácticamente no tiene inhibidores de PCR.

También necesitará algo de ADN polimerasa. Tal vez pueda pedir prestada una alícuota a alguien que trabaje en un laboratorio de biología.

Bueno, una idea increíble! Pero 4 oligo podrían costar más que 2 oligo porque necesito enviar oligo desde un país extranjero, por lo que el precio es un factor importante en mi experimento. De todos modos gracias por esa idea. Estoy encontrando otra forma más simple que esa cuando el ADN se puede encontrar en cualquier organismo vivo.
Creo que mi máquina de PCR es más barata, más rápida, especial porque uso un motor para llevar el tubo de 95 o C a 65 o C en solo unos segundos. Si te gusta mi PCR, te lo venderé más barato que el OpenPCR ;)
Edité mi respuesta: puedes hacer PCR con dos oligos sin ninguna otra plantilla de ADN. Esta es la forma más simple que creo.
@Alan, gracias, lo eliminé de la respuesta. Complete, no será útil para probar el termociclador.
Hola, ¿por qué eliminaste la respuesta editada? Parece una buena idea, ¿es posible si uso solo 2 oligo 3'-NNNNNNNNNNNNNNNNAAAAAA-5' y 5'-TTTTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNN-3'?
sí, se puede hacer usando dos oligos... pero es mejor no tener secuencias de baja complejidad como AAAAA y TTTTT, etc.
Usando solo dos oligos auto-recocidos como cebadores y plantilla, simplemente completará el in sin amplificación. La reacción se producirá incluso sin ciclos térmicos, lo que hace inútil la presencia de un termociclador. Quizás el peor experimento que se haya hecho para probar un termociclador :-) Gracias @Alan Boyd por señalarlo. Por cierto, los oligos normalmente se envían liofilizados a temperatura ambiente en pequeños tubos dentro de sobres normales, pedir 2 o 4 no afectará los costos de envío.

De todos modos, obtendrá cebadores y enzimas de algún lado. La mejor opción sería obtener un plásmido de cualquier biolaboratorio. La mayoría de los plásmidos tienen secuencias específicas como la secuencia del promotor M13 , la secuencia del terminador/promotor de T7 , etc. Estas son secuencias estándar derivadas de virus, que se usan comúnmente para los sitios de unión de cebadores para la secuenciación. Además, estos cebadores son bastante estándar y están optimizados para una fácil PCR y puede obtenerlos con bastante facilidad.

Estoy completamente de acuerdo con esto, pero el OP dijo: "una plantilla de ADN para pruebas que es fácil de encontrar y extraer " (énfasis mío)
Encontrar una combinación de plantilla/oligo para mi primer experimento de PCR
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