¿Eliminar la ARNasa de las pipetas?

Nuestro laboratorio utiliza pipetas Gilson Pipetman antiguas. He estado usando algunos para producir ARNm mediante transcripción in vitro y comencé a tener problemas con la ARNasa. Estoy tratando de limpiar todo, incluidas las pipetas. No estoy seguro de que estas viejas pipetas se puedan esterilizar en autoclave, al menos no en una sola pieza, creo que puedo desmontarlas y esterilizar en autoclave las partes que puedan estar en contacto con las soluciones. ¿Hay alguna forma de lavar las pipetas de manera efectiva y eliminar las ARNasas?

Utilizo cajas de puntas de barrera libres de ARNasa, hago todo mi trabajo en piezas nuevas de papel de aluminio, uso agua comercial libre de ARNasa, guantes, bata de laboratorio, mascarilla, etc. Sin embargo, los rendimientos del kit de transcripción in vitro se han reducido y los rendimientos del kit de cola son aún peores, a veces pierden el 90% del ARN. No puedo hacer mucho, nuestro edificio es viejo y está lleno de polvo y las malditas tuberías sobre mi banco de trabajo tienen fugas (todas las tuberías tienen fugas, tuve 2 grandes roturas de tuberías en los últimos 6 meses).

Probablemente tendré que conseguir nuevos kits. Solo tengo que demostrarle a mi asesor que los kits están contaminados.

Desmontaría las pipetas y colocaría las piezas correspondientes en la solución DEPC. También consideraría otros problemas además de las ARNasas, el rendimiento reducido puede tener muchas causas diferentes.
Desarmé las pipetas y sonicé las partes inferiores en RNAse Away, las enjuagué con ddH2O, luego con etanol al 70 % y después con autoclave. Reensamblado con nuevos sellos y juntas tóricas y verificado la calibración. Parecen estar bien hasta ahora. He estado usando este mismo kit durante aproximadamente 3-4 meses, por lo que ha tenido muchos descongelamientos por congelación. Tendrá que reemplazar pronto de todos modos. La ejecución de geles desnaturalizantes muestra manchas en lugar de bandas, lo que sugiere degradación.
También cambiaría todos los ingredientes para su transcripción in vitro si tiene algún problema con la ARNasa. También es posible que desee alícuotas adicionales de las existencias, para limitar los daños causados ​​por la contaminación y proteger las existencias más sensibles. Algunas cosas simplemente empeoran más rápido, la TDT debería ser razonablemente nueva y los NTP también empeoran notablemente si son más antiguos. Pero tampoco usamos kits sino que preparamos todo en nuestro laboratorio.
limpie el cuello de la pipeta con RNAseZap/RNAseAway y use puntas con filtro para su experimento. La degradación no se debe esencialmente a la contaminación por la pipeta: verifique sus tubos de plástico, puntas, tanques de gel, etc. También verifique el tampón que usa para sus geles (si se autoclavó, el pH es bueno). Y si su edificio tiene polvo, puede realizar los experimentos en una campana laminar.

Respuestas (1)

De acuerdo con la Guía del usuario de Gilson Pipettman , puede esterilizar en autoclave las siguientes piezas: el eyector de puntas, el soporte de la punta y la tuerca de conexión (eche un vistazo al PDF vinculado anteriormente si no está seguro de las piezas). Todas las demás partes no se pueden esterilizar en autoclave. Gilson dice que se pueden usar las siguientes condiciones (página 17 de la guía del usuario): Esterilizar en autoclave durante 20 minutos a 121 °C, 0,1 MPa.

Sin embargo, cuando realmente tenga una contaminación de ADNasa, no podrá deshacerse de ella con el autoclave, ya que las ARNasas son demasiado estables. Puede probar las diversas soluciones disponibles en el mercado que eliminan las ARNasas o simplemente obtener un nuevo juego de pipetas que se usan solo para el trabajo con ARN (en un banco diferente en un laboratorio diferente con un conjunto completamente nuevo y diferente de productos químicos y artículos de plástico) . Y recomendaría consejos de filtro para este trabajo. Son más caros pero a la larga te ahorrará dinero ya que no tienes que repetir los experimentos.

Con respecto a sus pipetas con fugas: Las pipetas contienen anillos de goma y sellos de teflón en el interior que deben reemplazarse de vez en cuando. La imagen a continuación muestra cómo (partes C y D), el anillo se puede comprar de Gilson. Si no sabe cómo hacer este trabajo (y no tiene un técnico que lo sepa), también puede enviar las pipetas para su reparación. Esto cuesta un poco de dinero, pero es mucho mejor que usar pipetas poco confiables y con fugas.

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Y no te preocupes, las pipetas Gilson son bastante buenas. He usado ahora más o menos todas las marcas del mercado y las sigo prefiriendo. Solo necesitan algún servicio de vez en cuando.

Las pipetas no tienen fugas, las tuberías tienen fugas. Es un problema de fontanería. Estoy limpiando las pipetas en este momento y tengo sellos y juntas tóricas de repuesto, así que espero que este problema se resuelva. No puedo arreglar las tuberías sin un plomero.
Tubería. De alguna manera hice esto en pipetas aquí. Probablemente también tenía demasiados con fugas :-)
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