¿Cuál es la relación entre la concentración de plásmido y los niveles de ARNm?

Supongamos una construcción sintética simple, que consta de un promotor constitutivo y un solo gen:construir

Una de las formas más simples de modelar la transcripción GFP es usar una ODE:

d [ GRAMO F PAGS metro R norte A ] d t = a b [ GRAMO F PAGS metro R norte A ]

dónde a es la tasa de transcripción de GFP y b es la tasa de degradación del ARNm de GFP (ambas constantes). Normalmente, suponemos a >> b .

Supongamos que deseamos tener en cuenta la concentración de plásmidos con el valor de la tasa de transcripción a - por ejemplo, con una mayor concentración de plásmido, la relación a / b debería aumentar ya que se espera que los niveles de saturación de ARNm se alcancen más rápido. En otras palabras, supongamos que transfectamos 2 construcciones individuales representadas anteriormente, 10 ng de una y 30 ng de la otra. ¿Cómo debería afectar esta diferencia de concentración a los valores de las constantes de velocidad, suponiendo que las construcciones sean idénticas?

Suponiendo esto, aproximadamente ¿cómo es la tasa de transcripción de genes? a cambia en función de la cantidad de plásmido transfectado que contiene la construcción anterior? Idealmente, me interesaría saber esto para las celdas HEK 293, pero cualquier otra estimación decente es aceptable. Una opción simple es simplemente asumir una relación lineal, pero creo que eso es demasiado simplista: por ejemplo, si decimos a = 1 a una concentración de plásmido de 10 ng, luego a = 3 a una concentración de plásmido de 30 ng. Tenga en cuenta que no me estoy limitando necesariamente a los modelos ODE, solo busco algún tipo de relación.

Hasta ahora no he podido encontrar nada útil en los documentos que he examinado, por lo que agradecería cualquier ayuda.

Respuestas (1)

La cantidad de plásmido transfectado no se correlaciona en absoluto con el nivel de expresión de la proteína. Después de la transposición, por lo general, cada célula obtendrá y conservará solo una copia del plásmido. Una vez que el plásmido esté en la celda, se replicará y la celda contendrá X copias del mismo, dependiendo del número de copias del plásmido. En general, los plásmidos con un bajo número de copias se correlacionan con una menor expresión de proteínas en comparación con los plásmidos con un alto número de copias. Pero también hay excepciones:

La expresión de genes bajo el control del promotor EF1α parece estar correlacionada con el número de copias del plásmido. Por el contrario, la expresión impulsada por el promotor temprano inmediato más tradicional de CMV parece menos sensible a la dosis (ref) del número de copias del plásmido .

Bueno... el número de copia también importa en el caso de CMV. Observé actividad de luciferasa normalizada en células HEK en diferentes cantidades de plásmido transfectado; muestra diferencia. Además, el efecto de un miARN sobre la luciferasa es mejor a medida que disminuyen las concentraciones. Sin embargo, no es estrictamente lineal.