Las secuencias RBS bicistroninas (BCD) desarrolladas por Mutalik et al. [1] tiene como objetivo eliminar la sensibilidad al contexto de la traducción y, por lo tanto, garantizar una expresión génica más predecible. Sin embargo, me han dicho que tener múltiples unidades transcripcionales, cada una usando BCD, puede enfermar a las células. La explicación que me dieron fue que la toxicidad proviene de pequeños péptidos que se producen a partir de la transcripción de la primera secuencia RBS.
¿Alguien ha demostrado toxicidad de múltiples BCD o es apócrifo? Si se ha demostrado, ¿se conoce el mecanismo de toxicidad y existe alguna forma de utilizar múltiples BCD manteniendo las células sanas?
[1] VK Mutalik et al., "Expresión génica precisa y confiable a través de elementos estándar de iniciación de transcripción y traducción", Nat. Métodos, vol. 10, núm. 4, págs. 354–360, abril de 2013.
Esa es una gran pregunta y tiene muchas oportunidades para explorar. No estoy seguro de que nadie haya seguido sistemáticamente este trabajo original de BCD. Intentamos clonar estos elementos en una copia mediana de plásmidos, en un diseño de operón, impulsando múltiples genes, y ahora que lo pienso, no fue algo inteligente. La clonación fue muy desafiante, probablemente debido a la toxicidad que mencionas. No tuve tiempo de investigar esto en profundidad (que en sí mismo es un proyecto genial), pero creo que la toxicidad se debe a demasiados recursos (¿ribosomas?) Titulados en estas unidades. Pero esa es una explicación ondulada a mano. Necesita estudio mecanicista para investigar. Creo que el grupo de Tom Ellis y otros han hecho un trabajo hermoso sobre la toxicidad asociada con la expresión de proteínas. Personalmente, creo que la toxicidad no está relacionada con el péptido inerte (primer gen en un operón BCD) que se produce.
Volviendo al uso de BCD para impulsar múltiples genes, diría que si los clona directamente en los genomas, deberían funcionar a la perfección. Probamos esto y funciona bien. No se ha publicado mucho (¡Dios mío, eso es tanto trabajo sin publicar!) Los operones bacterianos tienen estas uniones y elementos de diferentes fuerzas. ¡Feliz de discutir más si tiene una pregunta de seguimiento!
Gracias por su interés en este trabajo. Realmente orgulloso de nuestro trabajo en este sistema. Por supuesto, feliz de haber hecho este trabajo, ya que hubo muchos esfuerzos iniciales en estos elementos tipo BCD. ¡Y me encanta esta plataforma SE de discusión abierta! No sé cómo sobrevivió synbio sin este sistema de intercambio de conocimientos y experiencias. Los mejores deseos
Vivek Mutalik
En la documentación de este método de clonación reciente del grupo de Richard Murray en Caltech (https://doi.org/10.1021/acssynbio.8b00060) incluyen una biblioteca de piezas con varios BCD. No lo he probado directamente yo mismo, pero la advertencia que notan para múltiples BCD no es que sean tóxicos, sino que debido a que tienen regiones homólogas largas, son propensos a la recombinación. Esto tiene sentido ya que la región peptídica ficticia tiene alrededor de 50 pb y se comparte entre todos los BCD. Podría imaginarse hacer variantes en esta región para combatir los problemas de recombinación, pero quién sabe si eso afectaría la solidez de la expresión BCD.