¿Cuál es el papel de CRISPR-dCas9 en los complejos reguladores de la transcripción gRNA-dCas9?

En este artículo 1 , leí que las versiones mutantes de las proteínas Cas, como Cas9 desactivado (dCas9), se usan junto con un ARN guía (ARNg) para formar variantes de la herramienta CRISPR que pueden funcionar como reguladores de la transcripción.

Dado que el mutante Cas9 ha perdido su funcionalidad de nucleasa, el complejo mutante gRNA-dCas9 puede "bloquear" factores de transcripción como la ARN polimerasa para que no se una a un gen determinado, por lo tanto, reprime la transcripción o la elongación.

Otra forma en que dCas9 puede regular la transcripción es "llevar" otro factor de transcripción, ya sea un activador o un represor, y esto se puede hacer mediante la ingeniería de un dCas9 fusionado con el otro factor de transcripción elegido.

Entiendo cómo el dCas9 puede bloquear la unión de otro factor de transcripción para reprimir el inicio o el alargamiento de la transcripción, pero ¿cuál es el punto de fusionar otro factor de transcripción con el dCas9? Me parece que en este escenario, el dCas9 es solo un portador pasivo del factor de transcripción que realmente está haciendo el trabajo, entonces, ¿por qué el factor de transcripción no puede fusionarse con el gRNA en su lugar, para que pueda afectar directamente la transcripción cuando el gRNA forma pares de bases complementarios con el gen objetivo, en lugar de estar en un dCas9 pasivo?

1. Jusiak, B., Cleto, S., Perez-Pinera, P. y Lu, TK, 2016. Ingeniería de circuitos de genes sintéticos en células vivas con tecnología CRISPR. Tendencias en biotecnología, 34(7), pp.535-547.

Respuestas (1)

Entonces, ¿por qué el factor de transcripción no puede fusionarse con el gRNA en su lugar, de modo que pueda afectar directamente la transcripción cuando el gRNA forma pares de bases complementarios con el gen objetivo, en lugar de estar en un dCas9 pasivo?

La razón principal de esto es que tanto el gRNA como la combinación de dCas9-TF (factor de transcripción) pueden (cada uno) codificarse genéticamente, mientras que una combinación de un gRNA con un factor de transcripción solo podría generarse químicamente.

La posibilidad de codificar genéticamente la unidad de ARNg dCas9-TF + permite:
a) utilizar métodos establecidos para transferir ADN a las células, de modo que las células produzcan el Cas9 y el ARNg por sí mismas y
b) generar células que expresen de forma estable la totalidad unidad (dCas9-TF + gRNA) para siempre.

Ninguna de estas opciones sería posible con un gRNA-TF ligado químicamente (que también es mucho más difícil de fabricar para los laboratorios de biología molecular que no cuentan con el equipo de química adecuado).

Gracias. Entonces, en un escenario más general, ¿es más convencional inducir la síntesis de un complejo gRNA-Cas9 por la propia célula, en lugar de administrar el complejo ya sintetizado en la célula?
Realmente no tengo experiencia con Crispr/Cas9, así que no puedo decirlo con certeza, pero definitivamente es más fácil transferir solo ADN (plásmidos) en las células y dejar que construyan las proteínas y el ARN, ya que la transfección de ADN es uno de los métodos de biología molecular más comunes. La transfección con proteína y/ARN es más difícil y, por lo tanto, menos convencional (pero todavía se usa a veces para Cas9, especialmente si NO desea que la célula retenga la proteína Cas9 de ninguna manera)
¿Cuál es el papel de CRISPR-dCas9 en los complejos reguladores de la transcripción gRNA-dCas9?
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