¿Cómo se haría para aislar un ARNm específico de un grupo de otros? [cerrado]

En primer lugar, debe averiguar cuál es su objetivo: un vector de expresión (es decir, un plásmido) que impulsará la expresión de un gen en bacterias (digamos, E.coli), y la secuencia de codificación de su gen debe estar aguas abajo del promotor en esa construcción.

Su tarea solicita una tarea de laboratorio bastante rutinaria conocida como clonación ( https://en.wikipedia.org/wiki/Molecular_cloning ). Su grupo de ARNm podría ser el resultado de una extracción de ARN de una muestra de tejido y su objetivo es obtener bacterias que produzcan gran cantidad de la proteína deseada.

Como esta es una tarea, solo daré una descripción general amplia y dejaré que descubras los detalles.

De hecho, una forma en que podría abordar esto es en realidad algún método para extraer específicamente el ARNm deseado, luego generar ADNc a partir de él y pegarlo en el vector. Es poco probable que esto le brinde buenas tasas de éxito y, en la práctica, nadie purifica un ARNm específico a menos que esté interesado en otras moléculas unidas naturalmente a ese ARNm.

Dado que este es un procedimiento con un propósito muy práctico sin una pregunta científica detrás, hay una forma mucho más eficiente de lograrlo.

1. Genere ADNc para todos los ARNm de la mezcla ("síntesis de ADNc de primera cadena").
2. En lugar de eliminar los ARN no deseados, simplemente amplifique el que desee utilizando cebadores específicos que haya diseñado y PCR. Esto le da lo que se llama el "inserto".
3. Lo más probable es que si ordenó el vector de expresión en línea, en realidad reciba bacterias que lo contengan, por lo que primero debe cultivarlas y extraer el ADN del cultivo ("miniprep").
4. El siguiente paso es pegar el ADN en el vector de expresión. Para esto, necesita digerir tanto el vector como su inserto usando las mismas enzimas de restricción ("digerir restricción"). (Su inserto no tendrá sitios de restricción, por lo que deberá introducirlos diseñando los cebadores para la PCR en el paso 2 de manera adecuada).
5. Ejecute las mezclas de digestión de restricción en un gel (electroforesis), identifique las bandas correspondientes al inserto en un carril y al vector en el otro, y extráigalas (extracción en gel).
6. Ligar el inserto y el vector
7. Transformar el producto terminado en E.coli competente