¿Existen métodos para el marcaje de nucleótidos que sean compatibles con el uso de la transcripción inversa, además del radiomarcaje, y para los cuales el marco regulatorio en la UE/EE.UU. sea permisivo? Las obligaciones reglamentarias en torno a los radionucleidos son demasiado estrictas.
Los nucleótidos marcados con biotina se pueden incorporar en el ADNc mediante transcriptasa inversa. Jena Bioscience, un proveedor de nucleótidos marcados con biotina, tiene una tabla que muestra qué químicas de nucleótidos se han utilizado con éxito con la transcriptasa inversa, aunque tendrá que profundizar en las hojas de datos de productos específicos para obtener las referencias.
Una referencia provista en la página del producto para biotin-11-dCTP:
APOBEC3G inhibe la elongación de los transcritos inversos del VIH-1
Este estudio analiza la transcripción inversa endógena natural (nERT) en el VIH. De los métodos:
Para este ensayo, se realizó una reacción nERT esencialmente como la anterior, con la excepción de la adición de dNTP: los viriones sedimentados se resuspendieron en PBS, MgCl2 2,5 mM , melitina 15 µg/ml y biotina-11-dCTP 0,5 mM (Jena Bioscience) , y se incubaron a 37°C.
Sí, la biotina es una opción no radiactiva utilizada para el etiquetado de nucleótidos. Varias enzimas utilizadas para incorporar este nucleótido marcado con biotina son: polimerasa Taq para la reacción en cadena de la polimerasa, polimerasa de ADN para la traducción de Nick, transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney para la transcripción inversa, exonucleasa Klenow para la extensión del cebador y desoxinucleotidil transferasa terminal para el etiquetado del extremo 3'.
La detección de estas sondas marcadas con biotina se realiza utilizando estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o perlas de agarosa/magnéticas.
https://www.promocell.com/f/product-information/manual/PK-CA-BIO-DUTP-1000P.pdf )