¿Cómo depende la alta fidelidad de la replicación del ADN de la formación de enlaces de hidrógeno?

La ADN polimerasa debe catalizar la adición de 4 nucleótidos diferentes a la hebra en crecimiento. Esto significa que no puede determinar directamente qué base incorporar en un punto específico (cómo 'sabría' qué base incorporar y cómo cambiaría su especificidad para diferentes bases). Esto significa que la especificidad de qué par de bases incorporar depende de la hebra de ADN molde.

El apareamiento correcto de bases de Watson-Crick (es decir, enlaces de hidrógeno) entre la hebra molde y el nucleótido que se va a incorporar desencadena el cierre del dominio del dedo de DNAP alrededor de la unión cebador-plantilla y coloca a este último en la posición óptima para la catálisis (con el$\ce{\alpha-PO_4}$del nucleótido entrante cerca del$\ce{3'-OH}$del cebador para un ataque nucleofílico catalizado por dos$\ce{Mg^{2+}}$iones). Aquí es donde entra en juego el residuo de tirosina conservado que mencionaste. Un nucleótido emparejado incorrectamente no desencadenará este cambio conformacional y no se posicionará de manera óptima, por lo que la catálisis es menos probable.

Además, la ADN polimerasa hace contacto con el surco menor de la unión cebador-plantilla a través de enlaces de hidrógeno. Esta interacción no es específica de base (todos los pares de bases de Watson-Crick tienen el mismo patrón de aceptores de enlaces de hidrógeno en el surco menor), sino que solo ocurre cuando se incorpora el nucleótido correcto, estabilizando así el complejo.

Finalmente, la discriminación entre ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos se realiza por exclusión estérica de los$\ce{2'-OH}$por residuos de aminoácidos en el bolsillo de unión.

Estos factores pueden considerarse como una corrección cinética, ya que simplemente ralentizan la velocidad de reacción y dan tiempo para que un nucleótido emparejado incorrectamente se disocie. Sin embargo, aún se pueden incorporar y muchas ADN polimerasas tienen un$\ce{3'->5'}$exonucleasa correctora que puede eliminar nucleótidos emparejados incorrectamente. Esta revisión está nuevamente mediada por interacciones entre el DNAP y la unión cebador-plantilla (es decir, enlaces de hidrógeno con el surco menor). Una interacción debilitada debido a una base emparejada incorrectamente reduce la afinidad entre el ADN y el sitio catalítico y aumenta la afinidad entre el ADN y el sitio de corrección (porque tiene preferencia por escindir el ssDNA del extremo 3').

Las polimerasas de ADN de alta fidelidad tienen varias medidas de seguridad para protegerse contra la comisión y la propagación de errores al copiar el ADN.

Tales enzimas tienen una preferencia de unión significativa por el nucleósido trifosfato correcto frente al incorrecto durante la polimerización.

Si un nucleótido incorrecto se une al sitio activo de la polimerasa, la incorporación se ralentiza debido a la arquitectura subóptima del complejo del sitio activo. Este tiempo de retraso aumenta la oportunidad de que el nucleótido incorrecto se disocie antes de la progresión de la polimerasa, lo que permite que el proceso comience de nuevo, con un nucleósido trifosfato correcto (1,2).

Si se inserta un nucleótido incorrecto, las ADN polimerasas correctoras tienen una línea de defensa adicional

Se detecta la perturbación causada por las bases mal emparejadas, y la polimerasa mueve el extremo 3´ de la cadena de ADN en crecimiento hacia un dominio de exonucleasa 3´→5´ de corrección. Allí, el nucleótido incorrecto es eliminado por la actividad exonucleasa 3´→5´, después de lo cual la cadena vuelve al dominio polimerasa, donde la polimerización puede continuar.

De: Laboratorios biológicos de Nueva Inglaterra:

https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/polymerase-fidelity-what-is-it-and-what-does-it-mean-for-your-pcr

Tanto la oración se puede entender a partir de la siguiente explicación.

En una hebra de ADN recién sintetizada, la ADN polimerasa forma extensos enlaces de hidrógeno con la base recién agregada cada vez que se agrega un nuevo nucleótido. (Primera oración) La polimerasa también forma enlaces con la columna vertebral del ADN de fosfato y azúcar. (Segunda oración)

La primera oración habla de cómo la polimerasa formará enlaces a través del surco menor del ADN recién sintetizado. La segunda oración habla sobre el cambio de un aminoácido de la ADN polimerasa (que es importante para formar enlaces con la columna vertebral del ADN). Este cambio de aminoácido provocará un error en el nucleótido agregado (ya que la polimerasa no está colocada correctamente, lo cual comprenderá en la siguiente explicación)

Estos enlaces de polimerasa y bases, junto con los enlaces entre el esqueleto del ADN y la polimerasa, posicionan a la ADN polimerasa.

Cuando un nucleótido recién agregado tiene un apareamiento de bases correcto, la estructura de las bases apareadas será tal que los enlaces formados entre la polimerasa y la base permitirán que la ADN polimerasa se posicione para la adición del siguiente nucleótido nuevo. Si se agregó un nucleótido incorrecto, la ADN polimerasa se posiciona de tal manera que su sitio de exonucleasa está en una posición para catalizar la actividad de la exonucleasa.

Por lo tanto, los enlaces de hidrógeno entre la base y la polimerasa son necesarios para el posicionamiento correcto de la polimerasa para permitir que se agregue el siguiente nucleótido (si se agregó la base correcta) o permitir la actividad exonucleasa de la polimerasa (si se agregó una base incorrecta). Esto ayudará en la revisión y, por lo tanto, proporcionará una alta fidelidad.