Espero medir las tasas de crecimiento de un cultivo bacteriano en varias condiciones de crecimiento. Me preocupa que estas condiciones de crecimiento puedan causar la muerte celular, lo que daría lugar a una menor correspondencia entre la densidad óptica y el número de células vivas, por lo que quiero medir de forma independiente el número de células vivas. Entiendo que sembrar diluciones en serie de un cultivo y contar la cantidad de colonias para calcular las Unidades formadoras de colonias (UFC) por ml es el estándar de oro para medir la cantidad de células viables. Sin embargo, tengo siete condiciones diferentes que quiero probar en paralelo, y hacer más de 3 placas para cada condición (para hacer diluciones en serie) y tomar medidas en varios puntos de la curva de crecimiento conduce a muchode platos En general, este método parece más laborioso de lo que necesito. Principalmente estoy haciendo esto como una verificación de cordura, por lo que parece mucho trabajo solo para una verificación de cordura.
Mi pregunta es: ¿existen métodos alternativos al enchapado de CFU para medir la viabilidad celular, dado que estoy haciendo muchos experimentos en paralelo? No tengo acceso a una máquina FACS, por lo que la clasificación de celdas no funcionará. He leído esta pregunta sobre la medición de células vivas en algas. No estoy seguro de que un hemocitómetro sea la alternativa adecuada para mi aplicación particular de alto rendimiento (aunque podría convencerme de lo contrario). La mejor respuesta a esta pregunta sería comparar por experiencia la precisión, exactitud, sensibilidad y facilidad de uso de este método alternativo con placas de CFU.
¡Gracias!
Solo lo he usado para trabajos con mamíferos, pero el Cedex HiRes Analyzer de Roche es bastante bueno. Desde sus documentos , puede analizar partículas de 1 a 90 μm de tamaño (las celdas con las que trabajo son de aproximadamente 20 μm), y hay un montón de opciones de configuración según sus necesidades. Siempre que sus células puedan teñirse con Trypan Blue (ha pasado mucho tiempo desde que hice un trabajo bacteriano, disculpe mi ignorancia) para ver la viabilidad, entonces esta máquina debería funcionar bastante bien. Cuando se establece en Máximo (es decir, el análisis tarda el mayor tiempo posible), obtengo resultados en menos de 4 minutos por muestra, y esto incluye aproximadamente un minuto para que la muestra se asiente en la celda de flujo. Si baja la sensibilidad, puede obtener resultados más rápido.
Básicamente, la forma en que funciona es que toma 300 μl de su cultivo líquido (diluido si cree que la concentración es demasiado alta) y lo agrega a una taza de muestra. Coloque todos sus vasos en la bandeja, complete la información de la muestra y las opciones de análisis en la pantalla MultiRun y presione Iniciar. La máquina incluye todos los reactivos a bordo, por lo que mezcla Trypan Blue con sus muestras y luego inyecta la cantidad adecuada en una celda de flujo. Se deja que la muestra se asiente y luego se toma una imagen de alta resolución de toda la longitud de la celda de flujo. Luego, dependiendo de su configuración de sensibilidad, se toma una cierta cantidad de fotogramas de la imagen de cuerpo entero y se analizan. Luego se genera un recuento promedio basado en todas las imágenes, y se escupen sus números finales. A continuación, puede imprimir o guardar un informe de los recuentos de células y la viabilidad.
El software también viene con algunas herramientas de análisis, por lo que si mantiene múltiples cultivos a lo largo del tiempo con diferentes condiciones de crecimiento, puede agregar los datos para cada uno y generar gráficos de recuentos de células, viabilidad, tamaño de células, etc. - hay en menos 10 o 20 parámetros para elegir. Todas las opciones de análisis de imágenes son configurables, por lo que si observa los resultados y cree que la máquina está seleccionando demasiadas células muertas o no las suficientes, puede cambiar los parámetros a su gusto y guardar las opciones como un tipo de análisis personalizado.
Una opción que me gusta que superaría el conteo basado en CFU (además del tiempo drásticamente reducido) es el hecho de que la máquina puede detectar la agregación de las células. Un problema con las CFU es que a veces es difícil saber que una determinada colonia realmente surgió de una sola célula madre; si deja que las colonias crezcan lo suficiente, es posible que pueda saberlo según el tamaño, pero es una decisión difícil. Dado que el Cedex está analizando las células en sí, no importa si están agregadas o no, ya que se contarán todas (suponiendo que la partícula de agregación no contenga una gran cantidad de células, como más de 50, eso no puede ser resuelto por el software debido a la oclusión de la imagen).
No sé cuánto cuestan estos tipos, por lo que, dependiendo de su presupuesto, es posible que no esté en el mercado para uno, pero si va a contar mucho, entonces uno de estos es invaluable. Estoy seguro de que otras empresas fabrican instrumentos similares, pero no los he usado, así que no sé cómo se comparan con los HiRes. Sé que la persona de mi empresa que fue responsable de comprar HiRes es muy buena investigando posibles alternativas, por lo que esta es probablemente la mejor opción que pudimos encontrar, para las necesidades que tenemos.
¡Buena suerte con tu conteo!
Una compañía llamada HemoGenix ofrece un ensayo alternativo/de reemplazo de CFU. Se llama HALO PCA (alternativa de células progenitoras). Lo hemos utilizado con gran éxito. Sin embargo, requiere un instrumento. Usamos un lector de placas de bioluminiscencia, pero parece que también tienen kits para la lectura de fluorescencia y absorbancia.
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