Preparación de la biblioteca genómica: ¿Por qué la enzima de restricción no corta el gen?

Actualmente estoy tratando de comprender más profundamente la creación de una biblioteca genómica. En la mayoría de los libros de texto que leí (así como en wikipedia), mencionaron que la biblioteca genómica se crea aislando el ADN y fragmentándolo con una enzima de restricción específica que corta aproximadamente tantas veces como genes. Sin embargo, eso no puede funcionar realmente, ¿verdad?

Digamos que E. coli tiene 4000 genes con 4,600,000 bpsgenoma Eso significa que debo generar fragmentos de más de 1150 bps en teoría (si cada gen tiene la misma longitud y no hay otras secuencias presentes). Eso significaría que necesito una enzima de restricción que corte alrededor de 4000 veces creando fragmentos de más de 1150bps. Así que usaría una enzima de restricción con un sitio de reconocimiento de 5bps (cortes cada 1024bps) o con 6bps (cortes cada 4096), por supuesto, solo si los pares de bases son aleatorios. Ahora ya ves, con la primera enzima de restricción cortaré (incluso en teoría) muchos genes, mientras que con la segunda podría obtener genes del tamaño adecuado pero también fragmentaré otros. Además, los genes, especialmente en organismos más complejos, no están espaciados por igual, sino que pueden estar concentrados en algunas áreas, mientras que en otras solo se ubican secuencias repetitivas. Entonces, ¿por qué todos los libros de texto mencionan que puedo crear una biblioteca genómica completa con una enzima de restricción? ¿No tendría más sentido cortar muchas copias de ADN al azar, tal como se hace para la secuenciación rápida, para obtener una mayor cobertura? Así que mi pregunta es, ¿cómo se prepara REALMENTE una biblioteca genómica sin saber nada sobre la secuencia? ¿Solo tienes en cuenta que muchos genes se cortarán por la mitad y esperas lo mejor? Parece una estrategia muy extraña para amplificar genes completos. ¿Cómo se prepara REALMENTE una biblioteca genómica sin saber nada sobre la secuencia? ¿Solo tienes en cuenta que muchos genes se cortarán por la mitad y esperas lo mejor? Parece una estrategia muy extraña para amplificar genes completos. ¿Cómo se prepara REALMENTE una biblioteca genómica sin saber nada sobre la secuencia? ¿Solo tienes en cuenta que muchos genes se cortarán por la mitad y esperas lo mejor? Parece una estrategia muy extraña para amplificar genes completos.

¡Gracias! :)

Respuestas (1)

Una biblioteca genómica se genera con el fin de encapsular el componente genético completo de un organismo.

Haces esto fragmentando el genoma con una enzima de restricción que corta en su secuencia de reconocimiento. Luego, estos fragmentos se toman y se clonan en un plásmido , de modo que luego se puedan secuenciar dentro del plásmido utilizando secuencias comunes que se encuentran en el plásmido pero no (generalmente) en el propio organismo. La secuenciación se realizaría tradicionalmente mediante la secuenciación de Sanger , que tiene un límite en cuanto a la duración de una secuencia que se puede hacer a la vez: una secuenciación realmente buena le dará ~1000 pb, con una calidad de secuencia que se reduce después de aproximadamente 600 pb.

La biblioteca genómica no está diseñada para la expresión: una vez que se identifican los genes, se pueden subclonar en un plásmido de expresión para ver qué hacen. Entonces, para este propósito, cortar un gen en fragmentos no es un problema, ya que encontrará el resto en otro plásmido y puede reconstruir el gen completo tomando los dos fragmentos y ensamblándolos.

La razón por la que usa la enzima de restricción es que la secuencia en la que corta también se usa para insertarla en el plásmido.

Entonces, en este punto, es posible que se pregunte cómo hace coincidir los extremos de los genes (o cualquier secuencia para el caso), cuando todos están cortados por una secuencia idéntica.

Bueno, la respuesta es que usa múltiples enzimas de restricción, ya sea solas o en combinación para generar una variedad de fragmentos cortados en diferentes sitios. Esto significará que una vez que cree las bibliotecas a partir de estas diferentes digestiones, puede secuenciar las diferentes bibliotecas y encontrar dónde se superponen los fragmentos, y luego ensamblar todas las secuencias en la secuencia original.

Por ejemplo, si miras la imagen de abajo. Si imaginas que los recuadros negros son el mismo gen, y el de arriba está cortado con la enzima de restricción A y el de abajo con B, puedes ver que las dos enzimas de restricción generan fragmentos superpuestos, así que si secuencias los fragmentos de ambos enzimas de restricción, puede encontrar dónde los extremos en A coinciden con otros en A, mirando los fragmentos en B.

ingrese la descripción de la imagen aquí

¡¡Gracias!! Entonces, supongo que las bibliotecas genómicas se usan principalmente para la secuenciación, mientras que las bibliotecas de ADNc se usan para la expresión (ya que siempre obtienes un gen completo), lo cual tiene sentido. Realmente me confundió, ya que en muchos libros de texto "generales", explican, que la creación de una biblioteca genómica se usa para, por ejemplo, encontrar un gen, que asocié con "quieren expresar ese gen más tarde". No entendí muy bien por qué querrías un gen fragmentado. Pero supongo que ahora tiene más sentido. ¡Gracias!
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