Estoy diseñando una construcción de genes sintéticos para expresar genes en E. coli impulsados por Ptet o PLAcO. La construcción se vería así:
-Ptet-(Gen1)-PLacO-(Gen2)-
Quiero expresar cada gen utilizando aTc o IPTG, pero quiero asegurarme de que la transcripción de cada gen se pueda controlar de forma independiente.
Digamos que solo agrego aTc y la transcripción se inicia en la ubicación de Ptet, ¿la ARN polimerasa chocaría con LacI unido al promotor PLAcO y dejaría de transcribir? ¿O eliminaría la transcripción de LacI (Gen 2)? No estoy seguro de si es necesario o no incluir la secuencia terminadora para asegurarme de que la expresión de cada gen esté desacoplada.
¡Buena pregunta! En primer lugar, asegúrese de tener múltiples secuencias de terminación/detención de la transcripción al final de su primer gen. Este es un procedimiento bastante estándar. También en su caso, el fenómeno llamado interferencia de transcripción (TI) es útil. Aquí hay una reseña sobre TI. En breve:
el término TI generalmente se refiere al impacto negativo directo de una actividad transcripcional en una segunda actividad transcripcional en cis.
Aunque TI se define principalmente como dos eventos de transcripción que se afectan entre sí, en el nivel bajo, la base es que dos proteínas unidas al ADN afectan la actividad de la otra. Ahora, dado que la función de LacI es inhibir la transcripción, por lo tanto, está fuertemente unida al ADN y yo diría que incluso si una polimerasa de alguna manera se desliza a través de las señales de poliA al final del primer gen, es probable que sea detenida por el LacI ya unido. en el segundo promotor.
Alternativamente, podría poner un promotor débil opuesto al primer gen e impulsar su expresión, de modo que colisionaría con la polimerasa que se aproxima del primer gen y la detendría antes de llegar al segundo gen. También aquí hay otro artículo sobre TI, que propone una red de regulación de genes basada en TI.
perry
Nandor Poka