Fiabilidad de la secuenciación de Sanger

Aclamado como el "estándar de oro" de la secuenciación, me preguntaba a qué debe la secuenciación de Sanger su increíble precisión. Si es posible, me gustaría una cuantificación de la precisión (porque dudo que sea del 100%, aunque posiblemente muy cerca).

Entiendo la terminación de la cadena ddNTP y las estrategias involucradas en la secuenciación de Sanger, pero me falta la conexión con la precisión.

¡Gracias!

* En la búsqueda, encontré algo conocido como "programas phred" que habían proporcionado niveles de confianza tempranos para la secuenciación de Sanger. Sin embargo, no veo directamente la correlación con la secuenciación moderna de Sanger.
No creo que se le llame el estándar de oro únicamente por su precisión, sino porque fue prácticamente el único método utilizado durante unos 20 años antes de que se hablara de las técnicas de segunda generación. Sin embargo, la secuenciación de terminación de cadena es precisa y, en teoría, solo está limitada por la tasa de error de la polimerasa. Dicho esto, las técnicas de próxima generación también son precisas.
Aquí hay algunas comparaciones de precisión: hindawi.com/journals/bmri/2012/251364/tab1
Gracias por las comparaciones! Personalmente, he oído que la secuenciación de Sanger a veces incluso se usa para confirmar las pruebas de próxima generación, y su precisión del 99,999 % es la esperada. Pero estoy de acuerdo en que la próxima generación está mejorando, tanto en precisión como en comodidad.

Respuestas (1)

La fiabilidad proviene del hecho de que en la secuenciación de Sanger (AFAIK) se separa la síntesis de la nueva hebra a la plantilla y la lectura real de la secuencia. Como sabrás, Sanger seq utiliza gel capilar elfo. separando así los fragmentos de ADN recién producidos en una sola diferencia de nucleótidos, y la lectura se realiza mediante detectores de fluorescencia (luego llamada de base, etc.). Ahora, en comparación con esto, los otros métodos de secuenciación como Illumina y 454 detectan cada incorporación de nucleótido que puede producir señales menos confiables. . Por ej. en Illumina, las colonias pueden superponerse en la placa, o en 454, la incorporación de múltiples nucleótidos en regiones de homopolímero hace que sea difícil decidir cuántos nucleótidos se han incorporado realmente. También se debe tener en cuenta que la calidad de las señales/lecturas no es constante a lo largo de la secuenciación de Sanger. El comienzo y el final de las lecturas tienden a tener señales ruidosas y de baja calidad, por lo que en realidad solo el segmento de 100-500 (-600) pb del fragmento completo se puede leer de manera confiable. Además, SOLID de ABI utiliza un espacio de color de 2 colores y cada base se lee dos veces y es extremadamente fiable (los inventores dicen que el 99,96 %). Además, los algoritmos inteligentes de corrección de errores y llamada de base pueden mejorar la precisión.

Vale la pena decir que los secuenciadores de próxima generación también logran una alta precisión al aprovechar su rendimiento/salida inmersos: debido a la amplificación clonal de las secuencias de plantilla, cada fragmento original se secuencia varias veces y los errores en una sola lectura se pueden corregir mediante el uso de otros.

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