Evolución dirigida: mutación puntual vs inserción-eliminación vs barajado

En general, las mutaciones puntuales se introducen en las proteínas de interés durante la evolución dirigida. Estas pueden ser mutaciones específicas en el sitio activo de una enzima si desea cambiar su especificidad hacia un nuevo sustrato, por ejemplo. Las mutaciones puntuales se pueden introducir con cebadores cuando amplifica su gen de interés. Sin embargo, si no sabe específicamente qué cambios hacer, entonces sí, una forma de generar mutaciones es mediante PCR propensa a errores o mediante PCR de cambio rápido. Si desea ver si un determinado cambio de aminoácido elimina la actividad/estabilidad/etc., haría un escaneo de alanina ( https://en.wikipedia.org/wiki/Alanine_scanning ).

No he escuchado mucho sobre la introducción de eliminaciones o inserciones para la evolución dirigida. En primer lugar, tienen que estar dentro del marco, para que la secuencia de codificación general no cambie. Las personas suelen introducir etiquetas de epítopos en el extremo N o C por dos razones: 1) para purificar las proteínas; 2) para aumentar su solubilidad. Pero, en general, la introducción de la deleción dará lugar a cambios impredecibles en la estructura 3D de la proteína de interés.

La mezcla de ADN se usa muy a menudo para la evolución dirigida. Aquí hay una figura de un artículo de Nature [1] que describe la mezcla de ADN. La forma en que generalmente se realiza es mediante el uso de homólogos de secuencia de la proteína de interés. Los diferentes fragmentos se pueden obtener mediante amplificación por PCR e introduciendo superposiciones cortas con los fragmentos vecinos. Luego, los fragmentos se pueden ensamblar mediante varios métodos, incluido el ensamblaje de Gibson y la recombinación de levaduras homólogas. La ventaja de la combinación aleatoria de ADN sobre la introducción de mutaciones individuales es que tiene que seleccionar menos mutantes y la actividad/estabilidad de la proteína podría mejorarse varios cientos de veces más.

Figura de mezcla de ADN de [1]

Curiosamente, una mezcla de ADN usando un método llamado SCHEMA [2]fue desarrollado en el laboratorio de Chris Voigt. En pocas palabras, SHEMA es un algoritmo computacional utilizado para identificar los fragmentos de proteínas, o esquemas, que se pueden recombinar sin perturbar la integridad de la estructura tridimensional. Se basa en la estructura 3D (de uno de los padres) y un alineamiento de las secuencias parentales. Calcula las interacciones entre residuos y determina el número de interacciones que se interrumpen en la creación de una proteína híbrida. Se define una ventana de residuos w y se cuenta el número de interacciones internas dentro de esta ventana. Se desliza la ventana y se crea el perfil del esquema. Por ejemplo. en la figura siguiente, el número de interacciones que se rompen en las posibles quimeras es 0 en la quimera derecha y 3 en la quimera izquierda. La quimera correcta se utilizará en la proyección.

Método SHEMA de [2]