Al transformar E. coli con un plásmido modificado genéticamente, ¿con qué rapidez/frecuencia se "pierde" este plásmido debido a mutación, transferencia horizontal o "dilución" sobre la reproducción durante varias generaciones?
¿Con qué frecuencia se pierden/mutan/diluyen los plásmidos insertados en E. coli? ¿Cuánto tiempo esperaría observar la salida de los plásmidos después de la transformación?
Hay muchos factores que pueden influir en la estabilidad de un plásmido. Describiré cuáles son los factores principales, pero para determinar exactamente qué tan estable es su plásmido, lamentablemente solo tendrá que probarlo. He proporcionado enlaces a algunos estudios que hacen esto al final.
El número de copias se refiere a cuántas copias de su plásmido están presentes en cada celda. Esto puede oscilar entre 1 y 10 para plásmidos con un número de copias bajo y entre 300 y 500 para plásmidos con un número de copias alto. En general, los plásmidos con un número de copias bajo se pueden perder más fácilmente que los plásmidos con un número de copias alto, ya que existe una mayor probabilidad de que el plásmido no esté presente en una de las células después de la división. ( https://www.nature.com/articles/s41598-017-05219-x )
Los plásmidos muy grandes (en el rango megabase) tienden a ser menos estables que los plásmidos más pequeños, ya que los organismos, especialmente E. coli , pueden tener dificultades para replicarlos. Esto significa que con el tiempo, menos plásmido estará presente en su sistema. ( https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.0c00008 )
Típicamente, los plásmidos sintéticos tendrán un marcador de selección codificado que se usa para proporcionar presión selectiva para mantener el plásmido. El marcador exacto utilizado puede afectar la estabilidad del plásmido, ya que algunos son más efectivos que otros. Este documento tiene una buena comparación de dos marcadores diferentes y mide la estabilidad de los plásmidos para cada uno: https://bmcbiotechnol.biomedcentral.com/articles/10.1186/1472-6750-8-61 .
Los plásmidos normalmente contienen un inserto que codifica su sistema. Algunas inserciones tendrán una carga relativamente baja en la célula (por ejemplo, baja expresión de una proteína pequeña). Otros pueden implicar una alta expresión de muchas proteínas o proteínas que son tóxicas para la célula. Las mutaciones son mucho más probables en los plásmidos de alta carga en comparación con los plásmidos de baja carga. Esto se debe a que las células que contienen plásmidos con mutaciones que reducen/detienen la expresión tendrán una ventaja de aptitud mucho mayor que las células con plásmidos no mutados. En otras ocasiones, estos plásmidos mutados se volverán dominantes y eventualmente perderá su plásmido original. Hay buena lectura sobre la carga celular aquí ( https://2019.igem.org/Team:Austin_UTexas/Measurement ) y aquí ( https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25849635/ ).
Esto es anecdótico, pero logré ejecutar experimentos de 24 horas con plásmidos de aproximadamente 5 kb de tamaño que contenían un inserto de baja carga y sin usar ningún marcador de selección sin ver pérdida de plásmido. También he tenido problemas incluso para clonar plásmidos de aproximadamente el mismo tamaño pero con selección de antibióticos y una inserción de alta carga sin que ocurra ninguna mutación. Así que realmente depende de cuál sea tu plásmido y de lo que exprese.
Aquí hay algunos ejemplos de cómo puede medir la estabilidad del plásmido:
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