¿Qué procedimientos usaría para aislar y amplificar la integrasa? Si estoy tratando de estudiar la enzima integrasa que se encuentra en el VIH, ¿cómo 1) destruiría la cápsula viral para liberar su contenido? 2) separar la integrasa de otras enzimas y del ADN viral. 3) hacer copias de la enzima para la prueba. ¡Cualquier ayuda sería muy apreciada!
Cada virus contendría cantidades extremadamente bajas de enzima (probablemente unas pocas moléculas individuales, en el mejor de los casos); recolectar y concentrar suficientes virus para extraer una cantidad significativa de enzima sería largo y difícil, si es que es posible.
La estrategia habitual en los laboratorios de investigación es clonar la secuencia de ácido nucleico que codifica para esta proteína (ya sea mediante amplificación directa a partir de una célula infectada por el VIH, o mediante la síntesis de un trozo de ADN in vitro) e integrarla en un vector de expresión, es decir, una pieza más grande de ADN, generalmente circular, adecuada para la integración en una célula huésped (humana o incluso bacteriana) y que lleva las secuencias necesarias para la persistencia y la expresión génica. De esta manera, puede producir miles de copias de la enzima que le interesa en cada célula y luego puede purificar una cantidad significativa de integrasa para estudiarla.
Para facilitar la purificación, es una práctica común agregar al gen una secuencia que codifica una "etiqueta de purificación", es decir, algunos aminoácidos adicionales que tienen propiedades especiales que hacen que la proteína final sea más fácil de purificar. Muy comúnmente se usan tramos de 6-8 residuos de histidina. La suposición es que la proteína que lleva esta etiqueta tendrá una actividad similar a la enzima natural, después de la purificación.
David