¿Cuándo es necesaria una técnica estéril estricta? Clonación frente a expresión de proteínas

Antecedentes: anteriormente trabajé con ARN, y luego usamos campanas de flujo laminar para cualquier trabajo en el que hagamos placas o inoculación de cultivos mientras aplicamos una técnica estéril. Ahora estoy trabajando en un laboratorio de bioquímica. Me dijeron que puedo trabajar en una mesa de laboratorio, mientras realizo la clonación básica para la producción de plásmidos en E.coli, y no necesito usar un mechero Bunsen siempre que aplique una técnica estéril (y en la mayoría de los casos no No veo a la gente esterilizando el banco con cautiverio antes del trabajo). Sin embargo, si hago algún trabajo relacionado con la expresión de proteínas, entonces debo usar el mechero Bunsen mientras aplico una técnica estéril.

Pregunta: ¿Es realmente para que ni siquiera tenga que usar un mechero Bunsen mientras realiza la siembra (E.coli normal: células XL1-azules)? en este caso, ¿por qué? ¿No hay siempre algo en el laboratorio que pueda crecer en placas de kanamicina? No usamos cribado blanco/azul, simplemente esparcimos células XL1-azules en placas LB con kanamicina, luego elegimos una colonia de tamaño promedio para hacer un cultivo LB. Me parece que tenemos suerte de que generalmente elegimos la colonia correcta (lo que confirmamos mediante la secuenciación después de la mini-preparación).

Como se respondió, puede prescindir de la llama para cosas que no desea almacenar durante un período prolongado de tiempo. En mi experiencia, si abres una placa de kanamicina durante un par de minutos, solo 1 de cada 10 placas tendrá algún tipo de contaminación, casi siempre algún tipo de hongo. Sí, hay cosas que contaminarán tu plato, pero no tanto.

Respuestas (2)

La respuesta corta es que nunca está de más practicar una técnica aséptica minuciosa.

Mi regla general es que, si abro un cultivo de bacterias (placas, eppendorfs, tubos, etc.), lo hago bajo un bunsen, con la excepción de si planeo lisar las células de todos modos.

Para la purificación de proteínas, la técnica estéril es importante si planea almacenar la muestra por un tiempo. Las proteasas en el medio ambiente y en su muestra/usted mismo pueden hacer que el trabajo destruya todo su arduo trabajo.

Nunca confíe plenamente en sus antibióticos. Por un lado, a menudo no detendrán los hongos, lo que arruinará sus muestras incluso en presencia de algunos químicos bastante desagradables. Si está usando algunos de los antibióticos más malos (la ampicilina es un excelente ejemplo), el antibiótico se degrada con el tiempo. Los B-lactámicos en particular son un problema, ya que la B-lactamasa se secreta a los medios. Para el día 2 de un cultivo, ¡básicamente no quedará ampicilina!

La ampicilina es un punto muy importante. Una vez tuve que entrenar a algunas personas que siempre fallaban en su maxiprep. Después de pasar por cada paso muchas veces, vi que habían hecho muchas soluciones congeladas de ampicilina y las habían mantenido a -20 durante 6 meses o más. Nunca uso ampicilina congelada de más de 1 mes, guárdala como polvo seco hasta que la necesites.

Para la mayoría de las preparaciones de plásmidos, no es necesaria una técnica estéril estricta. Los antibióticos en los medios seleccionarán las bacterias que llevan un plásmido resistente, por lo que normalmente no tiene que preocuparse por la entrada de otros organismos.

Sin embargo, cuando usa varios tipos de plásmido, debe tener cuidado para evitar la contaminación cruzada, ya que cada plásmido es resistente, por lo que las bacterias transformadas con el plásmido A vivirán bien en la placa del plásmido B. Al sembrar sus células, asegúrese de pasar su esparcidor de células a través de una llama. No tiene que ser un mechero Bunsen oficial, usé un mechero de alcohol muy bien.

Si hace una botella grande de medio y usa alícuotas pequeñas a la vez, entonces la botella solo debe abrirse dentro de la campana.

eso suena racional, sin embargo, ¿qué hay de la expresión de proteínas? porque también usa antibióticos allí, pero he oído que, por ejemplo, el bacilo es una bacteria de laboratorio muy común que llega a todas partes y crece bastante rápido incluso con antibióticos. Quiero decir, hay una buena razón por la que los medios se esterilizan en autoclave antes de usarlos, aunque use antibióticos. ¿Por qué no debo tener la misma consideración con la expresión de proteínas usando, por ejemplo, rosetta que con la clonación básica usando XL1-blue?
@CuriousTree Nunca he hecho mucha expresión de proteínas, pero creo que parte de por qué podemos salirnos con la nuestra con condiciones asépticas menos que ideales con la preparación de plásmidos es el tiempo. Nunca dejamos que la bacteria crezca más de 24 horas, luego lisamos y purificamos el ADN. Más tiempo que eso y los antibióticos no son confiables. ¿Durante cuánto tiempo se cultivan sus cultivos proteicos? ¿Mantienes las células congeladas? ¿Planeas descongelarlos y comenzar nuevas culturas con ellos?
la degradación de los antibióticos es un buen punto, normalmente cultivamos la célula desde la mañana y luego expresamos nuestra proteína durante la noche antes de la cosecha, y no la volvemos a cultivar. En total crecen unas 24 horas, en presencia de kanamicina y cloranfenicol.
Eso solo es cierto si los plásmidos A y B son diferentes pero contienen la misma base de resistencia. Un plásmido de kanamicina no sobrevivirá con cloranfenicol y viceversa.
@JoeHealey No hay tantos genes de resistencia a los antibióticos, por lo que es común tener dos plásmidos diferentes con el mismo gen. Los laboratorios en los que he estado también tienden a usar el mismo vector para todos nuestros genes, por lo que todos tienen la misma resistencia.
Sí, estoy de acuerdo, es importante tener en cuenta los genotipos de sus muestras. También existen variables de confusión adicionales, por ejemplo, la kanamicina y la neomicina tienen la misma base de resistencia, por lo que no se pueden usar para matarse entre sí;)
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