Soy físico de formación, así que disculpe si no uso la terminología adecuada.
Creo que hay una forma de hacer un sensor que detecte si un solo anticuerpo ha captado algo del flujo. Así que estoy tratando de averiguar si este sería un sensor útil, pero esto depende de qué tan específicos sean realmente los anticuerpos.
Cuando les pregunto a los biólogos "¿Qué tan específicos son los anticuerpos?", responden: "Muy, muy específicos", pero no proporcionan valores que yo entienda a nivel microscópico. Pero estoy tratando de hacer una estimación cuantitativa, por ejemplo, para el siguiente experimento mental:
Supongamos que he adjuntado un anticuerpo a la superficie inorgánica. Es un anticuerpo para atrapar el objeto X. Y fluyo sangre sobre la superficie, lentamente. Supongamos que no hay X en esta sangre en absoluto. Pero hay muchas (tal vez 10 17 , o algún número loco como ese) de otras partículas perdidas que fluyen por este anticuerpo cada segundo, ¿verdad? Entonces, cuando una de estas partículas choca con este anticuerpo, ¿cuál es la probabilidad de que se adhiera a este anticuerpo? ¿Es realmente 10 -17 ? ¿Es realmente tan pequeño?
Y, en cualquier caso, ¿cómo estimo esta probabilidad al menos en 1-2 órdenes de magnitud?
Además, ¿cómo calculo el "área de la sección transversal de colisión" a través de la cual un objeto tiene que volar para intentar unirse a un anticuerpo? En otras palabras, ¿solo tiene que tocarlo levemente o chocar contra el anticuerpo en una colisión dura y desordenada?
¿La probabilidad de unión exitosa depende de la velocidad del flujo?
¿Cómo cambiarían los valores si tomo suero en lugar de sangre?
¿Podría señalar algunos artículos, libros o simplemente palabras clave relevantes? Agradecería mucho cualquier ayuda.
TL; DR La especificidad del anticuerpo puede no ser excelente. Puede dar resultados falsos positivos hasta en el 90% de los experimentos. Sin embargo, algunos ensayos son 90% específicos.
Esa es una pregunta interesante y seguro que se han realizado muchas investigaciones para comprender la especificidad y la fuerza de la unión del anticuerpo a su objetivo.
En primer lugar, permítanme decir que la interacción anticuerpo-epítopo es, como muchos procesos biológicos, un proceso probabilístico, lo que significa que puede ir en cualquier dirección, sin embargo, después de unirse, el anticuerpo necesita mucha más energía o tiempo para "caerse". Siempre se requiere contacto directo para el establecimiento de un enlace no covalente entre el anticuerpo y el epítopo, porque la longitud característica de esa interacción es muy baja (del orden de angstroms, 0,1 nm y menos). El punto aquí es que no necesita ejecutar el anticuerpo en la corriente, más bien déjelo reposar en la solución con su muestra o mezcle suavemente, el movimiento térmico aleatorio se encargará de que se encuentren entre sí. En flujo, desperdiciará una gran cantidad de anticuerpos, lo cual es costoso.
Creo que puede estimar la probabilidad de que un anticuerpo dado se una a una molécula determinada a partir de sus estructuras 3D, pero este es un cálculo extremadamente engorroso. Lo que puede hacer experimentalmente, supongo, es etiquetar el epítopo "correcto" con una etiqueta roja fluorescente, y cada otra molécula en su solución con una etiqueta verde. Luego pase la solución a través de la columna con el anticuerpo asentado en perlas (como en la cromatografía), eluya todo y compare la señal verde con la roja. Midiendo con precisión, esto le dirá cuánto anticuerpo "basura" se extrajo de la solución.
Ahora, a los números. Aquí Abcam habla de su anticuerpo para la progesterona. Las moléculas, estrechamente relacionadas con la progesterona, se reconocen con una eficiencia del 40-90 %, en comparación con el objetivo positivo verdadero (progesterona). Pero este es el peor de los casos, porque esas moléculas están estrechamente relacionadas.
Por otra parte, la especificidad de los anticuerpos es muy importante cuando se utiliza el ensayo, por ejemplo, para el diagnóstico del VIH. Aquí hay una buena página de U Penn, que analiza problemas con especificidad:
Por ejemplo, en un estudio de 290 000 donantes de sangre asintomáticos de Minnesota que donaron 630 000 unidades de sangre, la tasa de falsos positivos cuando tanto el análisis de detección como el de confirmación fueron positivos fue del 0 % por donación (intervalo de confianza del 95 %: 0 % a 0,0006 %).
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Por ejemplo, en un estudio de donantes de sangre italianos asintomáticos, solo alrededor del 13 % de los donantes con pruebas de EIA repetidamente reactivas se confirmó que estaban infectados por el VIH sobre la base de inmunotransferencias positivas. Sin embargo, en una población de alto riesgo, la tasa de falsos positivos puede ser mucho más baja, tan baja como 1-3%.
No pude encontrar datos o estudios más precisos. En imágenes biológicas (mi campo), los anticuerpos se dividen en grupos "funciona" y "no funciona, déjalo" (también conocido como fondo alto).
Aclare, cuando dice "anticuerpo", ¿se refiere a un anticuerpo monoclonal (donde cada anticuerpo es idéntico y, por lo tanto, una población pura), o se refiere a un anticuerpo policlonal (que es una mezcla de anticuerpos que reconocen el mismo antígeno, pero cada uno puede estar reconociendo diferentes epítopos en el antígeno)? Un Ab monoclonal (mAb) reconoce un único epítopo.
Los libros de texto y los catálogos de proveedores a menudo actúan como si la unión de Ab fuera absoluta, como si no pudiera medir las tres cantidades: concentración molar de antígeno libre, concentración molar de mAb libre y concentración molar del complejo de antígeno de anticuerpo unido. En otras palabras, como si cada anticuerpo estuviera completamente ocupado todo el tiempo, una vez que el Ab encuentra una molécula de antígeno libre. Pero creo que puede discernir de las discusiones y respuestas anteriores que no todos los Ab se crean por igual.
En los casos en que las personas han medido este Kd (la constante de disociación) para un anticuerpo de unión "fuerte", el valor es del orden de 10EE-14 o menor (según recuerdo). Cuando decimos unión estrecha, generalmente queremos decir que la llamada velocidad de desconexión es muy lenta, con un t1/2 del orden de horas. En una reacción típica, la tasa de activación suele estar limitada por la tasa de difusión y no puede ser más rápida (¡pero busque discusiones sobre cómo la proteína de unión al ADN lac Repressor encuentra sus objetivos con una cinética que es más rápida que la tasa de difusión!)
El dispositivo que está describiendo (que detecta eventos de unión utilizando proteínas fijas en una superficie y proteínas objetivo en solución) mide la resonancia de plasmón superficial, y en un momento estuvo disponible para su compra bajo la marca BIAcore. Fue desarrollado por Mel Simon, en CalTech.
Por último, si su objetivo es una forma automatizada de usar reactivos de anticuerpos para detectar cantidades de antígeno cada vez más pequeñas en una mezcla compleja de fluidos, haría bien en familiarizarse con el radioinmunoensayo (RIA), puede ser exquisitamente sensible. Tenga en cuenta que todas estas técnicas diferentes tendrán un límite inferior de detección, por lo que un resultado negativo ("No pudimos medir nada de proteína X en la muestra de este paciente") siempre debe considerarse con la condición de "usar este ensayo de detección en particular". Entonces es un tipo de nivel de confianza.
meñique
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