¿Hay alguna regla (no debería ser exacta) para estimar los cambios cinéticos en una enzima si realicé alguna mutación en ella?
Si no puedo estimar los nuevos valores cinéticos, ¿es posible al menos aclarar o sugerir alguna explicación para la nueva cinética después de mutar una enzima según la mutación puntual que hice en ella?
Entonces, quiero explicar los cambios en los parámetros cinéticos (Km / Vmax) en mi enzima después de mutarla, ¿tal vez dependiendo de la estructura 3D ? o la carga/tamaño de los nuevos aminoácidos? ¿O cualquier otro factor que pueda usar para sugerir algo lógico sobre cómo y por qué le sucedieron esos cambios a mi enzima después de mutarla?
Lo necesito para mi disertación y todavía estoy totalmente perdido, cualquier idea (con las referencias adecuadas) será genial. Realmente aprecio cualquier ayuda.
Computacionalmente, utilizando simulaciones de dinámica molecular (MD), es difícil, pero no imposible, reproducir cuantitativamente el efecto de las mutaciones en las energías libres de unión a ligandos y las energías libres de activación y reacción de las reacciones enzimáticas. Los métodos de simulación MD más útiles para tal fin son: perturbación de energía libre (FEP), energía de interacción lineal (LIE), aproximación de respuesta lineal (LRA), enlace de valencia empírico EVB) y sus combinaciones---desarrolladas por Arieh Warshel ( El Premio Nobel de Química 2013).
Mecánicamente, las mutaciones afectan a las interacciones de corto (van der Waals y electrostáticas) y de largo alcance (electrostáticas) con el entorno circundante, que comprende el resto de la proteína y el disolvente. Tenga en cuenta que la energía libre es un atributo de un conjunto, no de una sola estructura 3D, razón por la cual es poco probable que explorar una sola estructura de la proteína mutada revele el efecto de la mutación cualitativamente, por no mencionar cuantitativamente. Uno tiene que muestrear el espacio conformacional de la proteína, y la simulación MD es la técnica computacional más eficiente para tal muestreo.
En resumen, los efectos son simples, pero el sistema es extremadamente complejo. . .
Klvana et al. (2012) Bioquímica 51: 8829-8843 .
Klvana et al. (2016) J. Física. química B120: 13017-13030 .
Lo que estás preguntando no está del todo claro: ¿quieres predecir el efecto de las mutaciones? ¿O quiere dar sentido a los datos de cinética experimental que comparan la enzima de tipo salvaje con mutantes puntuales?
Para predecir los efectos de las mutaciones, idealmente necesita una estructura tridimensional de la enzima en complejo con un análogo de sustrato. ¿Existe tal estructura en el PDB para su enzima? Esto le ayudaría a razonar sobre los efectos potenciales de las mutaciones puntuales. Si no existe tal estructura, solo puede confiar en las alineaciones de secuencias (y posiblemente en las estructuras de enzimas homólogas, si se han resuelto) para determinar qué residuos son importantes para la unión al sustrato y la catálisis.
KM está relacionado con la afinidad de unión de la enzima por su sustrato. Entonces, cualquier mutación que, por ejemplo, interrumpa un enlace H entre la enzima y su sustrato aumentaría la K M .
Cualquier mutación que se dirija a un residuo catalítico (por ejemplo, una cadena lateral de un aminoácido que actúe como un catalizador ácido-base) afectaría a k cat (y, por lo tanto, también a la Vmax ), y podría aumentar o reducir su tamaño según la mutación.
Si está tratando de dar sentido a los datos cinéticos experimentales, entonces pregúntese por qué eligió estas mutaciones en primer lugar. Uno usualmente muta residuos para probar una hipótesis. ¿O está tratando de comprender los efectos de las mutaciones naturales?
do you want to predict the effect of mutationsSí. Is there such a structure in the PDBSí. any mutation that for example disrupts an H-bond between the enzyme and its substrate would increase KM.¿por qué? eso no tiene sentido para mí. Sin hacer referencia a ningún estudio que demuestre que no puedo confiar en él.
Jeppe Nielsen
usuario37894