Estoy revisando el artículo "La dimerización de la glucoforina A está impulsada por interacciones específicas entre hélices alfa transmembrana". Hay una declaración en abstracto que no entiendo:
"El dominio transmembrana alfa-hélice de interés se fusiona con el extremo C de la nucleasa estafilocócica. La quimera resultante se puede expresar a altos niveles en Escherichia coli y se purifica fácilmente".
Según tengo entendido, ¿esto describe que una hélice alfa dentro de la glicoforina A se fusiona con la nucleasa de estrafilococo? Entonces, ¿cómo entra en discusión Escherichia coli y qué significa ser fácilmente purificado?
Básicamente, diseñaron un vector que, cuando se transfecta a E. coli, produce transcripciones de un gen de fusión y, por lo tanto, proteínas para un gen de fusión que produce estas hélices α transmembrana conjugadas con la nucleasa estafilocócica. En otras palabras, las E. coli son solo fábricas para producir proteínas:
Expresión, extracción y purificación de SN/GpA - Para altos niveles de producción de SN/GpA, pT7SN/GpA se transformó en E. coli MGT7 (amablemente proporcionado por D. LeMaster), que contenía el plásmido pLYS-S.
Y el razonamiento allí fue propuesto en la discusión,
Presentamos aquí el uso de una proteína quimérica para demostrar que la presencia del dominio transmembrana de GpA, fusionado con una proteína soluble normalmente monomérica, es suficiente para mediar en la dimerización de esta proteína de membrana artificial en SDS.
Lo que quieren decir con fácilmente purificada es que la proteína se puede extraer con relativa facilidad, y en el método experimental explican algunos métodos comunes de purificación:
La purificación en un solo paso de cantidades de miligramos de SN/GpA del extracto podría lograrse mediante HPLC de fase inversa utilizando un gradiente de acetonitrilo/alcohol isopropílico/agua en una columna semipreparativa Vydac C4. Alternativamente, la purificación de cantidades más grandes se logró usando dos rondas de cromatografía de intercambio catiónico...
... La quimera SN/GpA131, pero no las formas truncadas, podría alterar NaCl, Tris-HC1 50 mM, EDTA 5 mM, PMSF 1 mM, NaNa al 0,025 %, extraerse de forma nativa mediante sonicación del sedimento después de la lisis celular en pH 1 M 7.9, sin detergente. Esta extracción tuvo una eficacia similar a la de Lubrol y se utilizó en la preparación de material para la generación de péptido transmembrana mediante tratamiento con tripsina.