¿Cómo se diseñan los anticuerpos?

Trabajé durante mucho tiempo en una empresa líder en anticuerpos de alta calidad, así que intentaré compartir algunas de mis experiencias con usted. El proceso de fabricación de un anticuerpo altamente específico (me centraré en los monoclonales) consta de tres partes importantes: diseño e inmunización del antígeno, clonación y subclonación, y detección/validación. Cada parte es crucial en sí misma, y ​​cuanto mejor se realice, mayores serán sus posibilidades de éxito en el futuro.

Para que un anticuerpo funcione, debe unirse específicamente a su objetivo. No entraré en todos los detalles aquí, ya que existe una buena literatura abierta sobre el diseño de antígenos, pero básicamente necesita algo que promueva una fuerte respuesta inmune en el huésped, le brinde una variedad de clones para elegir y sea específico: no debe unirse a otros objetivos además de su proteína de interés. Hay muchos factores a considerar, que incluyen antigenicidad, solubilidad, facilidad de producción (para inmunización y detección), consideraciones estéricas (¿otra proteína o ácido nucleico oscurece el sitio objetivo in vivo??), y otros. Los antígenos se pueden dividir aproximadamente en dos tipos: péptidos (normalmente menos de 20 o 30 aminoácidos) y proteínas o fragmentos de proteínas. Lo más probable es que desee probar varios antígenos para maximizar su probabilidad de éxito. Después de sintetizar y purificar el antígeno, debe elaborar un programa de inmunización para preparar y estimular a los animales, luego determinar cuándo y cómo analizarlos (detección) y en qué momento y cómo recolectarlos para el proceso monoclonal.

Luego viene el proceso de clonación. Los clones se pueden generar mediante una variedad de métodos, algunos ampliamente disponibles, como los diversos métodos de hibridoma, y ​​algunos propiedad de compañías individuales. Mi empresa anterior empleaba una combinación de ambos, dependiendo de la especie de animal, utilizando una tecnología interna realmente genial que se mejoraba y ampliaba constantemente. Estos procesos dependen mucho de la calidad de los materiales que se utilizan y de la experiencia de los clonadores. Las células B de entrada (que producen los anticuerpos) deben haberse recolectado, tratado y almacenado de acuerdo con un conjunto de pasos precisos para permitir la mayor cantidad de clones viables. Una vez obtenidas las células inmortalizadas (tras la fusión con las células compañeras de mieloma en el proceso de hibridoma, por ejemplo) se diluyen hasta un recuento de células predeterminado y se colocan en placas de 96 pocillos y se dejan recuperar y crecer durante un tiempo, durante el cual secretan anticuerpos en el medio. Luego, este medio se prueba rápidamente (antes de que las células crezcan demasiado), y los pozos positivos se diluyen (con suerte) en suspensiones de una sola célula y se subclonan o congelan para más adelante. La primera prueba suele ser mediante ELISA con el antígeno inmunizante, aunque dependiendo de su aplicación de interés, puede ser mediante detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Después de la prueba inicial, los pasos subsiguientes de subclonación y nueva prueba pueden ocurrir a un ritmo más medido, ya que las células pueden congelarse indefinidamente después de generar cantidades suficientes de anticuerpos en el sobrenadante. Luego, este medio se prueba rápidamente (antes de que las células crezcan demasiado), y los pozos positivos se diluyen (con suerte) en suspensiones de una sola célula y se subclonan o congelan para más adelante. La primera prueba suele ser mediante ELISA con el antígeno inmunizante, aunque dependiendo de su aplicación de interés, puede ser mediante detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Después de la prueba inicial, los pasos subsiguientes de subclonación y nueva prueba pueden ocurrir a un ritmo más medido, ya que las células pueden congelarse indefinidamente después de generar cantidades suficientes de anticuerpos en el sobrenadante. Luego, este medio se prueba rápidamente (antes de que las células crezcan demasiado), y los pozos positivos se diluyen (con suerte) en suspensiones de una sola célula y se subclonan o congelan para más adelante. La primera prueba suele ser mediante ELISA con el antígeno inmunizante, aunque dependiendo de su aplicación de interés, puede ser mediante detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Después de la prueba inicial, los pasos subsiguientes de subclonación y nueva prueba pueden ocurrir a un ritmo más medido, ya que las células pueden congelarse indefinidamente después de generar cantidades suficientes de anticuerpos en el sobrenadante. aunque dependiendo de su aplicación de interés, puede ser mediante detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Después de la prueba inicial, los pasos subsiguientes de subclonación y nueva prueba pueden ocurrir a un ritmo más medido, ya que las células pueden congelarse indefinidamente después de generar cantidades suficientes de anticuerpos en el sobrenadante. aunque dependiendo de su aplicación de interés, puede ser mediante detección de alto rendimiento mediante citometría de flujo, inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Después de la prueba inicial, los pasos subsiguientes de subclonación y nueva prueba pueden ocurrir a un ritmo más medido, ya que las células pueden congelarse indefinidamente después de generar cantidades suficientes de anticuerpos en el sobrenadante.

Aquí es donde entra en juego la calidad de su programa de detección. Sus ensayos deben estar bien diseñados, sólidos, bien documentados y realizados, y tener controles positivos y negativos apropiados para que pueda saber realmente si un determinado clon es de interés, o funciona mejor que un producto existente. Esto significa condiciones controladas, reactivos y protocolos estandarizados y un alto grado de repetibilidad de un ensayo a otro. Además, la idoneidad de sus controles no se puede enfatizar lo suficiente. ¿Tiene una muestra no expresiva o no expresiva para comparar, o una forma de ver la actividad basal frente a la inducida o inhibida? Para ChIP, a menos que tenga un buen anticuerpo de control y un par de cebadores para su gen de interés, ¿cómo sabrá si el ensayo funciona? Puede obtener un gran resultado haciendo un Western blot de inmunoprecipitación directo, pero todavía no tira hacia abajo la proteína unida al ADN. Si su método ChIP no produce ADN limpio, es posible que nunca se una. Y si no cuenta con los protocolos de análisis de datos apropiados con múltiples pozos replicados, puede perder el tiempo persiguiendo el ruido en lugar de una señal específica. Además, además de probar todos sus clones, también necesita titularlos para determinar la concentración de trabajo óptima. He visto muchos anticuerpos que se ven como basura cuando prueba el supe por primera vez, pero diluidos 100 o 1000X son limpios, específicos y aún fuertes. Sea paciente, la prueba es mucho trabajo y requiere muchas repeticiones para confirmar sus resultados, pero al final valdrá la pena. Si no cuenta con protocolos de análisis de datos apropiados con múltiples pozos replicados, es posible que pierda tiempo buscando ruido en lugar de una señal específica. Además, además de probar todos sus clones, también necesita titularlos para determinar la concentración de trabajo óptima. He visto muchos anticuerpos que se ven como basura cuando prueba el supe por primera vez, pero diluidos 100 o 1000X son limpios, específicos y aún fuertes. Sea paciente, la prueba es mucho trabajo y requiere muchas repeticiones para confirmar sus resultados, pero al final valdrá la pena. Si no cuenta con protocolos de análisis de datos apropiados con múltiples pozos replicados, es posible que pierda tiempo buscando ruido en lugar de una señal específica. Además, además de probar todos sus clones, también necesita titularlos para determinar la concentración de trabajo óptima. He visto muchos anticuerpos que se ven como basura cuando prueba el supe por primera vez, pero diluidos 100 o 1000X son limpios, específicos y aún fuertes. Sea paciente, la prueba es mucho trabajo y requiere muchas repeticiones para confirmar sus resultados, pero al final valdrá la pena. He visto muchos anticuerpos que se ven como una porquería cuando prueba el supe por primera vez, pero diluidos 100 o 1000X son limpios, específicos y aún fuertes. Sea paciente, la prueba es mucho trabajo y requiere muchas repeticiones para confirmar sus resultados, pero al final valdrá la pena. He visto muchos anticuerpos que se ven como una porquería cuando prueba el supe por primera vez, pero diluidos 100 o 1000X son limpios, específicos y aún fuertes. Sea paciente, la prueba es mucho trabajo y requiere muchas repeticiones para confirmar sus resultados, pero al final valdrá la pena.

Finalmente, después de hacer todo esto, es de esperar que tenga un gran clon que haga lo que usted quiere que haga, y mejor que cualquier otra cosa que exista. Ahora debe decidir qué va a hacer con él, porque si es un laboratorio académico y publica con él, el mundo llamará a su puerta. No se afloje al final y decida que 100 ml de sobrenadante serán suficientes para durar para siempre: guarde los clones y colóquelos en un banco de células, o intente obtener un acuerdo de comercialización con una empresa de fabricación para que no tenga que hacerlo. haz todo el trabajo!

Espero que esto ayude, por favor hágamelo saber si tiene más preguntas o inquietudes.

Respondiendo al comentario de Konrad, usted produce el péptido o la proteína de interés utilizando bacterias o los sintetiza químicamente (la síntesis química generalmente solo funciona para cadenas peptídicas cortas. Después de lo cual, obtiene muchos productos secundarios). Este péptido o proteína de su interés sirve como su antígeno. Inyectas este antígeno en ratón o conejo. El sistema inmunitario del animal montará naturalmente una respuesta inmunitaria para producir anticuerpos contra él. A continuación, se pueden recolectar las células B que son responsables de producir esos anticuerpos. Después de lo cual, básicamente sigues el protocolo que Matt indicó.

Por supuesto, también podría optar por aislar directamente el suero del animal y purificarlo. Sin embargo, esto conduce a la producción de anticuerpos policlonales que pueden ser menos específicos que un anticuerpo monoclonal.