¿Cuáles son las resoluciones espaciales (laterales y axionales) y temporales que se espera obtener con las siguientes técnicas de imagen óptica?
¿Son mejores que los demás para proporcionar resoluciones más altas?
La resolución lateral y axial depende de la apertura numérica de su objetivo (lateral = lambda/2NA; axial = 2lambda/NA^2). Puede mejorar la resolución axial con FLI utilizando un enfoque confocal o con microscopía de 2 fotones (2PM). En 2PM, necesita la absorción de dos fotones infrarrojos para obtener la emisión. La probabilidad de absorción de 2 infrarrojos depende cuadráticamente de la intensidad de excitación. Por lo tanto, la fluorescencia se restringe donde se enfoca el haz de iluminación, lo que proporciona un mejor corte. Una ventaja de 2PM es la mayor profundidad de penetración y reduce la fototoxicidad. De hecho, puede usar 2 fotones infrarrojos para excitar el fluoróforo que requiere excitación visible.
La resolución temporal depende del área que se quiera medir y del tiempo de integración.
La resolución está limitada por la difracción. En el mejor de los casos, con las 3 técnicas de imagen que mencionó, puede obtener ~ 200-300 nm en resolución lateral y 500 - 800 nm en resolución axial. Se puede lograr una resolución más alta utilizando técnicas de súper resolución. Están separados en dos grupos. El primero explota las propiedades fotofísicas del fluoróforo para excitarlo y desexcitarlo. Esto permite resolver áreas de sub-difracción. Este es el caso de la microscopía STED (Stimulated emision depletion) o SSIM (microscopía de iluminación estructurada saturada). El segundo grupo utiliza la fluctuación de la emisión de fluoróforo para localizarla mejor. Incluye técnicas como STORM (microscopía de reconstrucción óptica tocástica), PALM (microscopía de localización fotoactivada) y SOFI (imágenes de fluctuación óptica de superresolución).