¿Por qué el aumento de la concentración del vector no aumenta la eficacia de la transformación bacteriana?

Estaba leyendo una descripción antigua de los protocolos utilizados para la transformación de células bacterianas.

En la descripción leo que la transformación funciona mejor con poca cantidad de ADN, y si aumentamos la cantidad de ADN utilizada, la cantidad de células transformantes no aumenta proporcionalmente.

Solo me pregunto por qué, ya que en mi opinión, el proceso de ingreso a la célula está relacionado principalmente con los principios de difusión y, por lo tanto, depende de la concentración.

Si hay muchas veces más plásmidos que células, aumentar su concentración cuando las células ya están saturadas no aumentaría la tasa de transformación.
Gracias, pero entonces es similar a una cinética enzimática. Entonces, en teoría, tendré una mayor transformación a una mayor concentración de plásmido hasta un punto de saturación que, supongo, depende de la cepa que use para transformar.

Respuestas (1)

Según el protocolo de transformación de Hanahan (uno de los más altos publicados), una transformación de 200 µl contendrá 1 × 10 8 − 1.7 × 10 8 células.

Suponiendo que se utiliza el plásmido pBR322 , 1 ng de plásmido se convertirá en 0,36 fmol de plásmido, o 6 × 10 8 copias de plásmidos.

Como podemos ver claramente, incluso con cantidades muy bajas de ADN utilizado, hay múltiples plásmidos por célula. Dado que se cree que la transformación está mediada por los canales de ADN , el aumento masivo de las cantidades de ADN no aumentaría por igual la eficiencia de la transformación una vez que todos estos canales estén saturados.

El ejemplo de las células NEB Turbo DH5α parece mostrar esto bastante bien, que una vez que las cantidades de ADN superan 1 ng, la eficiencia de transformación cae precipitadamente.

ingrese la descripción de la imagen aquí

Dicho esto, si la cantidad de plásmidos disponibles es muy grande, no hay razón para evitar agregar más de 1 ng de ADN, ya que no reducirían el número total de colonias de transformación, sino solo la eficiencia.

Muchas gracias por tu bonita respuesta. Sin embargo, estoy pensando que en el ejemplo que haces habrá alrededor de 6 copias de plásmido disponibles por cada celda. Según tengo entendido, podría haber cientos de posibilidades (por ejemplo, canales de ADN, agujeros generados electroporéticamente) para que entre el ADN. Entonces, en teoría, si creamos una curva de saturación, podemos ver que la cantidad de transformantes aumenta con la cantidad de plásmido que agregamos , al menos al principio. Cuando se alcanza la saturación, la cantidad de ADN no influye. ¿No tendría sentido agregar más ADN desde el principio para tener un transformante más alto?
@efrem No estoy seguro de si la cinética de Michaelis-Menten (en el sentido de la curva de saturación) se aplica en este caso debido a la combinación de muchos medios diferentes de entrada de plásmidos, pero el concepto general de saturación de canal aún debería aplicarse.
¡Gracias! Entonces la eficiencia cae, pero el número de células transformadas aumenta exponencialmente. Por lo tanto, si alguien no está limitado en términos de cantidad de plásmido y tiene células que no se transforman tan bien, sería mejor aumentar la cantidad de plásmido para obtener una mayor cantidad de transformante, aunque con menos eficiencia.
@efrem El aumento es notablemente NO exponencial. De hecho, es peor que lineal, considerando que el eje X es logarítmico pero el eje Y es lineal. Sin embargo, en la mayoría de los casos de transformación bacteriana, en cualquier caso se utilizan plásmidos de alta concentración. No puedo pensar en una manera de reducir el número total de colonias de transformación agregando demasiado ADN.
cierto, lo siento De hecho, es lineal. De todos modos, me parece que no hay mayor inconveniente en agregar demasiado ADN (plásmido), en términos de número total de células transformadas.
¿Por qué el aumento de la concentración del vector no aumenta la eficacia de la transformación bacteriana?
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