Se espera que siga el crecimiento celular midiendo la concentración celular del cultivo en incubación cada 30 minutos más o menos. Entonces mis preguntas son: ¿Por qué necesito hacer una dilución en serie (suponiendo que lo haga)? ¿Por qué no puedo simplemente llenar una cubeta con el volumen de cultivo de incubación de la cubeta y compararlo con el blanco cada 30 minutos? Y si necesito diluir, ¿cuánto debo diluir (1:100, 1:1000, etc.)? Esto es para un cultivo lleno de E. coli.
Normalmente no es necesario diluir en serie cultivos de E. coli para mediciones espectrofotométricas, al menos en los experimentos en los que el valor de la DO es importante.
Para la mayoría de los trabajos de expresión de proteínas, el consenso es comenzar la inducción en OD 0,6, y para la mayoría de las células químicamente competentes, la OD óptima oscila entre 0,3 y 0,8 según el protocolo de competencia. En ningún momento es necesario realizar diluciones, ya que todas se encuentran dentro del rango lineal de la relación recuento de células:OD.
La única vez que necesita diluir el cultivo es cuando desea encontrar la OD de un cultivo muy concentrado (por ejemplo, después de 24 horas de incubación vigorosamente agitada).
La lectura de la densidad óptica de un cultivo microbiano en fase logarítmica a una longitud de onda fija se aproxima a la ley de Beer-Lambert, donde A = ecl. Esta relación no es lineal a medida que la absorbancia se acerca a 1,0, por lo que a densidades celulares más altas eventualmente se subestimará la densidad celular del cultivo. Del mismo modo, la ley no es precisa por debajo de una absorbancia inferior a ~ 0,05, por lo que una dilución de 10 veces debería estar bien. Eventualmente, el crecimiento de la cultura se ralentizará.
Debe diluir (no necesariamente diluir en serie) si:
Como tal, no hay problema de que la ley no se cumpla en ciertos límites de absorbancia.
Entonces, una regla general para la dilución de células es que la suspensión no debe verse muy turbia (debe poder ver su pulgar desde el otro lado del tubo de ensayo ;-)).
Depende de su propósito, pero puede sembrar células en una placa multipocillo y dejar que el lector de microplacas controle el crecimiento. Algunos lectores de microplacas pueden incubar células a la temperatura que usted establezca, agitar la placa y controlar la DO.