¿Es posible hacer medios anaeróbicos demasiado reductores?

He estado luchando para hacer crecer un anaerobio ( P. gingivalis ), tomo todas las precauciones para mantener las condiciones de cultivo libres de oxígeno, me preguntaba si las condiciones pueden ser tan reductoras que inhiban el crecimiento microbiano de un anaerobio obligado.

Para hacer los medios líquidos hago lo siguiente:

  • TSB suplementado con extracto de levadura
  • más 0,5 g/l de L-cisteína HCl como agente reductor
  • más resazurina como indicador redox
  • Rocíe calor con nitrógeno hasta que la resazurina se vuelva completamente incolora.
  • añadir hemina (5 mg/L) y vitamina K1 (1 mg/L) de soluciones madre (1mL/L hemina en agua, 200uL/L vit K1 en etanol)
  • filtrar-inyectar este medio en tubos de vidrio a los que se les ha quitado el gas (esto se lleva a cabo en una campana anaeróbica)
  • todos los materiales (jeringas, agujas, filtros, tubos) se han dejado en la campana anaeróbica antes de su uso para que no quede oxígeno residual dentro/sobre ellos
  • cambie el espacio de cabeza por una mezcla de gas de 80:10:10 N 2 :CO 2 :H 2

No obtengo ningún crecimiento después de más de 72 horas @ 37 o C.

Otros protocolos que he encontrado son mucho más vagos/laxos con respecto a la eliminación del oxígeno, muchos solo dicen que se debe agregar la cisteína y que los medios deben incubarse en una campana anaeróbica durante 24 horas con la tapa suelta antes de usarse. Esto me hizo pensar que tal vez estoy eliminando demasiado oxígeno.

¿Qué piensas?

Para que conste, obtuve el crecimiento del cultivo hoy, verifiqué el pH después del rociado y noté que estaba un poco bajo (6.6, en realidad debería ser 7.4), así que equilibré el pH a alrededor de 8.0 antes del rociado y el pH terminó alrededor de 7.0. Creo que podría hacerlo mejor y tener medios con un pH final de 7,4, pero ¡funciona!

Respuestas (1)

Noté que no especificas el pH, lo que podría ser importante.

No sé si puede poner demasiado agente reductor (sospecho que no), pero a menudo se requiere un gran exceso ya que las constantes de equilibrio para las reacciones de intercambio de disulfuro suelen estar cerca de la unidad (ver Cleland , 1963).

Tampoco sé si alguno de los siguientes tiene algo relevante para su problema (nuevamente, sospecho que no), pero quiero comentar brevemente dos aspectos del uso de tioles como agentes reductores en general.

En primer lugar, la forma oxidada (disulfuro) de los tioles puede reaccionar con una proteína sulfhidrilo. Usando β-mercaptoetanol como ejemplo ( Scopes , 1993, p 320), puede ocurrir algo como lo siguiente, donde el agente reductor se une (reversiblemente) a la proteína. Si el sulfhidrilo reactivo está en un sitio activo de la enzima, esto puede conducir a la inactivación.

(1) 2 H S C H X 2 − C H X 2 O H + O X 2 ⟶ H O C H X 2 C H X 2 − S − S − C H X 2 C H X 2 O H + H X 2 O X 2

(2) H O C H X 2 C H X 2 − S − S − C H X 2 C H X 2 O H + H S − Proteína ↽ − − ⇀ H S C H X 2 − C H X 2 O H + H O C H X 2 C H X 2 − S − S − Proteína  

Como se indicó, las constantes de equilibrio para las reacciones de intercambio de tioles suelen estar cerca de la unidad ( Cleland , 1963).

(3) R X 1 − S − S − R X 2 + R X 3 − S H ↽ − − ⇀ R X 1 − S − S − R X 3 + R X 2 − S H  
Por esta razón, muchos químicos de proteínas prefieren usar ditioles análogos de treitol (ditiotreitol, DTT o reactivo de Cleland ) o eritritol como agente reductor, ya que la forma oxidada de estos compuestos son disulfuros cíclicos, donde la constante de equilibrio está desplazada hacia la derecha ( véase Cleland , 1963).

También está la cuestión de la estabilidad.

La vida media de los tioles en solución depende marcadamente del pH y la temperatura, como muestra la siguiente tabla . La vida media del β-mercaptoetanol a pH 6,5 y 20 ℃ es superior a 100 horas, pero a pH 8,5 y 20 ℃ es de solo 4 horas.

 

stevens_stevens_price sobre la estabilidad del disulfuro

La tabla anterior se tomó de Stevens, R, Stevens, L & Price, NC (1983) The stabilitys of different thiol compound used in protein purifications , publicado en (el ahora desaparecido) Biochemical Education. El artículo completo está disponible gratuitamente en formato pdf desde el sitio web de Wiley

Gracias, es muy interesante. Estudiaré el uso de DTT como agente reductor predeterminado. Creo que al final el problema era el pH, lo ajustaría a 7,4 antes de clasificar, pero bajaría a alrededor de 6,6 después del rociado. No estoy seguro de por qué sería esto, podría ser la evaporación o algo de CO2 podría estar disolviéndose. De todos modos, parece que Porphyromonas gingivalis prefiere un pH más alrededor de 7.5
Creo que estoy de acuerdo contigo: que probablemente no puedas tener medios anaeróbicos que sean reductores para un anaeróbico obligado. Así que doy por respondida esta pregunta.
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