¿Cómo afecta el tamaño del inserto a la tasa de recombinación homóloga en la levadura?

Como señaló aandreev, cuanto mayor sea el tamaño del inserto en relación con los flancos, menor será la tasa de recombinación. Esto se debe a que el ADN del donante esencialmente se vuelve no homólogo. Vea las figuras a continuación:

Figura 1: Efecto del tamaño del inserto en la eficiencia de la recombinación. Kung et al. (2013) Appl Environ Microbiol. Marzo;79(5):1712-7

Figura 2: Efecto del tamaño del flanco sobre la eficiencia de la recombinación. Kung et al. (2013) Appl Environ Microbiol. Marzo;79(5):1712-7

Sin embargo, mencionaste que quieres hacer knockouts de genes. En este caso, solo necesita hacer una pequeña mutación (por ejemplo, introducir un codón de terminación prematuro).

El uso de herramientas de edición del genoma, como Crispr-Cas, ZFN y TALEN, aumenta la tasa de transgénesis mediante la introducción de roturas de doble cadena de ADN.

Estos también se pueden usar para hacer knockouts cuando NHEJ domina sobre HR como mecanismo de reparación del ADN. NHEJ es propenso a errores y puede causar indeles que pueden alterar la función del gen.

En mi opinión, existe una relación directa entre la probabilidad de recombinación y el tamaño del inserto. Las plaquitas más pequeñas con flancos más grandes se incorporan más fácilmente. Eso lo entiendo al revisar estudios basados ​​en el sistema Cas9/CRISPRs. Lo mismo debería significar mutagénesis HR en levadura.

Entonces, la respuesta corta será: las inserciones más cortas son más eficientes. Sin embargo, no pude encontrar ningún estudio de la relación entre la eficiencia de la recombinación y el uso de insertos más pequeños que el objetivo, o la relación entre los tamaños del objetivo y el inserto. Se usó el sistema Cas9/CRISPR para insertar el sitio loxP (34 nt) en lugar de ~10 pb en células madre embrionarias de ratones. Las personas generalmente intentan insertar GFP o algo similar en tamaño en lugar de secuencias genómicas más cortas.