Quiero clonar dos proteínas fluorescentes, ambas impulsadas por diferentes promotores en un plásmido que se usará para transformar B. subtilis en el locus amyE. Para esto, quiero usar el plásmido pSG1729 (Lewis y Marston, 1999), porque este plásmido se puede usar para la recombinación homóloga en este locus específico.
Ahora, el problema es que, debido a algunas razones (es decir, las ubicaciones de los sitios de restricción, mantener el gen de resistencia spc y eliminar el gen GFP actual), si quiero clonar dos genes en este plásmido, estarán muy cerca de entre sí (~ 10 pb). ¿Será esto un problema técnico o biológico después de la transformación? No creo que la posible lectura sea mala, ya que quiero que una de las proteínas fluorescentes (pHluorin) se exprese continuamente. ¿Tal vez una opción sería clonar los dos genes en direcciones opuestas?
Este es el genotipo actual del plásmido:
Ori amyE5' currentGFP Spc amyE3' bla
Si desea expresarlos en un operón, asegúrese de tener un RBS en el extremo 5' de cada secuencia de codificación. Si coloca uno de 10 pb en sentido descendente sin que tenga un RBS, se transcribirá, pero no se traducirá... Si desea más ayuda, pegue el código de ADN de cada uno como comentario.
WYSIWYG
bsubespora
WYSIWYG