¿Cómo funciona el cribado azul-blanco en la selección de E. coli que ha captado un vector plasmídico?

El vector plásmido al que me refiero es pCR 2.1 - TOPO. Agregué el vector a la E coli y los sembré en una placa LB+amp+X-gal, luego los incubé. Después de la incubación, las placas tenían dos tipos de cultivo bacteriano, uno blanco y otro azul.

Creo que los cultivos azules han aceptado el plásmido ya que pueden crecer con ampicilina, por lo que tienen el gen de resistencia a la ampicilina y pueden convertir el sustrato X-gal en azul a través del gen lac Z. Lo que me confunde son las colonias blancas. Si las colonias pueden crecer con ampicilina, seguramente han aceptado el gen porque tienen la resistencia, y seguramente deberían poder convertir el X-gal.

Entonces, ¿por qué no expresan el gen lac Z? ¿Es que el gen lac Z y la resistencia a la ampicilina no están en el mismo plásmido, o es que el gen lac z no llegó al plásmido?

¿Cuál fue la cepa de E. coli que usó? ¿Era este un kit de clonación TA? ¿También agregó inserto de ADN de algún tipo?
Creo que era la cepa k12, sí, era un kit de clonación TA, y agregué ADN de Aequoria victoria al vector que causó que la bacteria se volviera fluorescente.

Respuestas (1)

El cribado azul/blanco tradicional se configura de modo que las colonias azules se consideren negativas para el inserto y las colonias blancas sean positivas para el ADN recombinante. El gen responsable es el gen lacZ, o beta-galactosidasa. Esta enzima convierte un sustrato sintético, X-gal, en un compuesto azul insoluble.

El plásmido pCR2.1 TOPO es un plásmido de selección azul/blanco en el que las colonias blancas se consideran positivas para el inserto. La forma en que esto funciona es insertando la secuencia de ADN para clonar dentro de la región codificante de lacZ. Al tener cualquier ADN insertado que interrumpe las secuencias de lacZ, de modo que la enzima ha perdido su función (porque ya no se traduce correctamente en la bacteria). Por otro lado, la ausencia de inserto significa que lacZ se vuelve a unir y que la enzima completa se produce correctamente y, por lo tanto, puede metabolizar el sustrato X-gal para formar un colorante azul insoluble.

Esto tiene mucho sentido, sin embargo, si la E coli está creciendo en la placa, ¿seguramente por defecto esto significa que ha absorbido el plásmido porque tiene resistencia a la ampicilina? ¿Cómo sobreviven las colonias azules con la ampicilina si no han absorbido el plásmido?
El gen de resistencia a la ampicilina está codificado en el plásmido en una región diferente. Cada plásmido, con o sin inserto, contiene resistencia a la ampicilina. Cada colonia que crece en la placa ha absorbido un plásmido, así es como sobreviven, pero no todas tienen necesariamente un plásmido con el inserto.
Oh, ya veo, ¿entonces es una prueba para ver si el plásmido se ha ligado junto con el inserto, no para ver si el plásmido se ha insertado con éxito en la E coli?
¡Eso es correcto! Después de todo, el antibiótico se extiende por toda la placa, por lo que cualquier bacteria que crezca ya debe tener el gen de resistencia.
¿Cómo funciona el cribado azul-blanco en la selección de E. coli que ha captado un vector plasmídico?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 32v