bioseguridad lentivector

¿Cuántas recombinaciones se requieren para lograr un virus activo?

La FDA ha reconocido la probabilidad de que los lentivectores se puedan convertir en lentivirus de replicación activa si se recombinan con el tipo salvaje del VIH en un paciente VIH positivo. En este caso, se requieren dos eventos de recombinación para transferir la secuencia del lentivector a la secuencia del VIH (el mecanismo de transferencia es idéntico al caso de los lentivectores de primera generación).

Este artículo de VCU describe otro mecanismo a través del cual esto puede ocurrir en los sistemas de lentivector de primera generación , que consta de dos eventos de recombinación entre el lentivector y el plásmido auxiliar. Tenga en cuenta que los 3 genes gag, pol y env están presentes en el mismo plásmido, y que el plásmido está flanqueado por LTR. Los lentivectores de segunda generación, como el sistema pLKO , no padecen este problema y requieren VIH de tipo salvaje para producir lentivirus de replicación activa.

Para reducir la probabilidad de que esto suceda, los sistemas lentivectores de segunda y tercera generación dividen los genes en múltiples plásmidos, lo que luego requiere más eventos de recombinación para producir virus competentes para la replicación. Además, la cola poliA del 3' LTR se reemplaza para reducir la probabilidad de que ocurran eventos de recombinación.

Según el artículo de Addgene sobre bioseguridad del vector lentivector , el plásmido de transferencia del gen de interés (tanto la 2.ª como la 3.ª generación) tiene una deleción en la región 3' LTR que impide que se vuelva replicativamente activo. Por lo tanto, la única probabilidad de que ocurra la recombinación es que la línea celular que expresa el virus se replique con una cepa activa de VIH de tipo salvaje. Un ejemplo es este plásmido de transferencia pLKO , que contiene una LTR 3' truncada, lo que evita que la secuencia se replique fuera de E. coli , que la replica sin usar la LTR sino el origen de replicación del plásmido.

¿Son los virus activos producidos por recombinaciones más peligrosos en estado salvaje que el VIH de tipo salvaje?

Esto es difícil de responder, ya que la recombinación solo permite que se forme un virus activo, pero no garantiza que el virus sea peligroso. Los virus peligrosos son teóricamente posibles, pero requieren muchas más recombinaciones que el mínimo 2 para la competencia de replicación en sistemas lentivectores de segunda generación.

Por ejemplo, los sistemas de lentivector generalmente no codifican las proteínas virales vpr, vif, nef y vpu . Estas proteínas son necesarias para aumentar la infectividad del VIH en diferentes tipos de tejidos (pero no en células cultivadas como HEK293). La falta de estas proteínas en un hipotético lentivector competente para la replicación dificultaría significativamente su propagación en la naturaleza. La incorporación de estas proteínas es plausible pero extremadamente improbable, ya que se requerirán más eventos de recombinación cruzada.

Para usar su ejemplo, la proteína env que codifica la cubierta de proteína VSV reside en el plásmido de la cubierta. Dado que el lentivector competente en replicación formado por 2 eventos de recombinación será un pseudotipo que contiene solo las proteínas env del VIH , necesitará adquirir más el gen VSV para reemplazar sus proteínas env , ya que estos genes no están presentes en las mismas regiones. No hay homología entre las dos cadenas de ADN, lo que dificultaría significativamente la probabilidad de que el gen VSV se incorpore de alguna manera al VIH activo.

La adición de varias proteínas quiméricas y regiones LTR en lentivectores de tercera generación solo complica el asunto.

En general, no pude encontrar ninguna fuente que comparara la infectividad de estos transgénicos teóricos del VIH con el tipo salvaje. Sin embargo, aunque teóricamente es posible que un lentivector competente en replicación transgénica pueda tener mejor tropismo que el VIH al adquirir el gen VSV, la probabilidad de que eso ocurra es mucho menor que la de que se produzca en primer lugar.

¿Se puede detectar un lentivector mediante una prueba de VIH?

Con respecto a la pregunta final de si un lentivector puede detectarse mediante una prueba estándar de VIH, la respuesta es que la detección es posible si la persona que fue infectada con lentivectores ha obtenido una respuesta inmune a las proteínas gag del lentivector, y las cargas del lentivector son suficientemente alto.

Las pruebas de VIH son específicas para diferentes partes del virus, pero la mayoría de ellas se dirigen a la proteína viral p24 , que es un componente de la poliproteína gag .

También existen pruebas de VIH basadas en PCR, pero estas pruebas dependerían de los cebadores específicos producidos y de si la RT-PCR produciría un amplicón dada la secuencia específica de los plásmidos.

Dado que los genes gag están codificados en la mayoría de los sistemas de lentivector , es muy probable que cualquier persona infectada con un lentivector exprese anticuerpos contra p24 y, por lo tanto, dé positivo en las pruebas ELISA y Western blot, suponiendo que p24 y las cantidades de anticuerpos son lo suficientemente altas como para alcanzar el punto de corte.

No pude encontrar niveles de corte disponibles públicamente para los niveles de ELISA y Western blot, pero si (hablando hipotéticamente) a una persona se le inyectara una carga de lentivectores, probablemente daría positivo en la prueba del VIH. Sin embargo, dado que el lentivector no se está reproduciendo activamente, el sistema inmunitario lo eliminaría rápidamente.