Bajo número de copias de plásmidos

Tengo un plásmido con origen P15A que aparentemente tiene un número de copias bajo (ver aquí ). Esto explicaría por qué mis rendimientos de purificación para la digestión posterior son bajos (el gel muestra el plásmido después de la digestión y la limpieza con 5 µl cargados). Actualmente estoy cultivando mi plásmido que contiene E. coli en 5 ml durante la noche antes de hacer una minipreparación. Mi pregunta es si debo hacer crecer mis cultivos de 5 ml durante más tiempo (2 días) o simplemente dejarlo y hacer una cantidad mayor para Midiprep.

    gel de plásmido

También tengo curiosidad por saber qué controla realmente el número de copias del plásmido dentro de las células. Se agradecería mucho una explicación de la regulación del número de copias del plásmido.

¿Cuál es el nombre básico del plásmido? ¿Cuánto plásmido usó realmente para el resumen? ¿Cuáles son sus rendimientos de un miniprep?
@Chris Se llama pACYCHO, así que supongo que es un derivado del plásmido pACYC. Ah, y gracias WYSIWYG, no sabía que así era como se hacen los enlaces.

Respuestas (1)

  • Estoy seguro de que lo has hecho; solo una nota para los demás: haga una prueba de PCR para asegurarse de que el plásmido está allí.
  • Para las minipreparaciones, por lo general no se necesita un cultivo iniciador.
  • Si ha evaluado sus clones y ahora solo desea amplificar y conservar el plásmido para fines de clonación, elija un maxiprep con cultivos de 200-400 ml.
  • No haga crecer demasiado las células, su extracción se vuelve difícil y obtendrá rendimientos aún peores. Simplemente configure un cultivo enorme y agrupe las células antes de la extracción. Siempre sembrar y cosechar células que estén en fase de crecimiento exponencial.
  • Si necesita analizar el plásmido en busca de clones o algo así, realice una PCR de colonia, mantenga la colonia inoculada en un cultivo pequeño (haga una reserva de glicerol temporal si su selección lleva tiempo). Si la detección es positiva, incoule el cultivo iniciador para el cultivo maxiprep/gigaprep con este caldo.
Bajo número de copias de plásmidos
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 0v