¿Son mis plásmidos monocatenarios?

Gel de agarosa de un plásmido de un solo corte y el mismo plásmido sin tratamiento

Hola, en esta foto de gel de agarosa (70 voltios, 3,5 uL de gel rojo en 30 ml de TBE, 1 % de agarosa, 1 hora de funcionamiento), comprobé la digestión de un plásmido grande (15 Kbp, un sitio de corte). La teoría dice que el plásmido digerido (linealizado) debería migrar más lentamente que la forma superenrollada del no cortado (banda más grande del Plásmido No Digerido). En mi caso, el plásmido digerido es más rápido que el no digerido. Descubrí que mi plásmido digerido podría ser monocatenario ( http://bitesizebio.com/13524/how-to-identify-supercoils-nicks-and-circles-in-plasmid-preps/ ). ¿Crees que ese podría ser el caso?

Respuestas (2)

Usted supone que el plásmido no digerido está superenrollado, pero lo más probable es que tenga una forma circular relajada debido a las muescas de una sola hebra. Esta forma migra más lentamente que el ADN lineal.

Creo que la explicación más simple de lo que estás viendo es que el plásmido sin cortar está en forma de dímeros formados por recombinación entre círculos monoméricos. Estos se resolverían en moléculas lineales del tamaño de un monómero en la digestión.

No he visto esta idea de círculos monocatenarios antes, pero si sucediera, no creo que esta forma sea predominante y, por supuesto, tales círculos de ssDNA no se verían afectados por la digestión.

En mi opinión, el plásmido no digerido está bien, tal vez durante la digestión o después de que el plásmido se vuelva monocatenario.
¿Por qué el plásmido se convertiría espontáneamente de dsDNA a ssDNA, en su opinión?
No creo que el plásmido se convierta espontáneamente en ssDNA, pero tal vez haga algo mal, ¿tal vez algo como pipetear con demasiada fuerza? No sé. Mi tutor dice que la banda en el gel debe ser más alta. He hecho el corte 3-4 veces diferentes, también con una enzima diferente pero siempre con el mismo resultado.
¿Son mis plásmidos monocatenarios?
RespuestasAquíPolítica de privacidad1y, 2v