Separación de proteínas séricas basada en FPLC

En primer lugar, sugiero la electroforesis 2D como técnica para identificar diferencias en los niveles de expresión de proteínas/marcadores. Esta técnica le brindará una mayor resolución y facilidad para comparar su muestra básicamente en un solo paso/experimento. Una bonificación adicional una vez que determina su proteína de interés, puede eliminarla fácilmente y enviarla para un análisis de espectrometría de masas para identificar su proteína. En resumen, la electroforesis 2D separa la proteína en función de su pI (punto isoeléctrico) en la primera dimensión y luego por su tamaño en la segunda dimensión. Una vez que identifique la proteína de interés, puede purificarla siguiendo los pasos a continuación.

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Ahora a abordar el problema de separar sus proteínas para su análisis. El esquema general que puede seguir para separar una proteína es el siguiente:

1. Columna de intercambio de iones
2. Columna de interacción hidrofóbica (HIC)
3. Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

Intercambio de iones primero porque eluye la proteína de la columna usando una concentración creciente de sal (0 --> 1 M de NaCl). Mientras que necesita una alta concentración de sal para cargar la proteína en la columna HIC. Por lo tanto, el eluido de la configuración 1 se puede enriquecer fácilmente con 5M (Nh4)2SO4 y cargarlo en la columna HIC (sin diálisis). Además, las columnas de intercambio iónico y HIC son de alta capacidad cuya resolución se puede mejorar con gradientes de sal poco profundos. De ahí mi recomendación de usarlas primero. Sin embargo, si está seguro de que su marcador/proteína de interés es pequeño, puede usar directamente la columna SEC

La columna de intercambio de iones, como sugiere el nombre, separa las proteínas en función de su carga (menos ---> más iónicos, también tenga en cuenta la carga +/- de la proteína a ese pH importante). El tampón a utilizar para el intercambio de iones sería:

 1. Binding Buffer
    10-50mM Phosphate Buffer pH7.4 (plasma pH)
    0-25mM NaCl
 2. Elution Buffer
    10-50mM Phosphate Buffer pH7.4
    1M NaCl 

Use la menor cantidad posible de sal para obtener la unión más eficiente a la columna. La elución se realiza con un gradiente de NACL desde el 0 % del tampón de elución hasta el 100 % de elución en unos ~20 volúmenes de columna.

La columna HIC separa la proteína según la hidrofobicidad de la proteína. El orden de elución de la columna es menos --> más hidrofóbico.

1. Binding buffer
    10-50mM Phosphate Buffer
    1M (Nh4)2SO4 
 2. Elution Buffer
    10-50mM Phosphate Buffer
    (No Salt)

Puede encontrar un buen protocolo para HIC aquí. La elución también se realiza en ~20 CV con un gradiente de 0-100 % de tampón de elución, similar a la elución de intercambio iónico.

Finalmente, Size Exclusion o SEC separa las proteínas en función de sus tamaños. El orden de elución es mayor ---> menor tamaño. La columna se ejecuta en un modo isocrático, es decir, solo se utiliza un tampón. Composición tampón:

1. 50-100 mM Phosphate Buffer
2. 150mM NaCL

La sal en el tampón es para evitar la interacción no específica de la proteína con la columna, lo que podría provocar que la proteína eluya más tarde de lo necesario. Esto podría resultar en una mala resolución .

Lo más importante a tener en cuenta es que cada una de las columnas anteriores tiene sus propios conjuntos de advertencias. 1) Las columnas de intercambio iónico son específicas para la carga de proteína, por lo que terminará teniendo una gran cantidad de proteína que no se unirá a la columna en absoluto según el tipo (anión/catión) de la columna utilizada. 2) Del mismo modo, es posible que la columna HIC no se una bien a su proteína. Además, agregar 1M (Nh4)2SO4 precipitará proteínas que podrían incluir la proteína de su interés. 3) Las columnas SEC tienen un límite superior en el tamaño de la proteína que pueden aceptar, por encima del cual todas las proteínas eluyen juntas en el volumen vacío, lo que reduce la resolución (sin embargo, esto no debería ser un problema en su caso, ya que intenta separar el inferior ). proteína de peso molecular de las de mayor peso).

Finalmente, todos los pasos anteriores funcionan muy bien teniendo en cuenta que conoce la proteína que desea purificar (separar). Dado que ese no es el caso, tendrá que recolectar y ejecutar la electroforesis en gel SDS de las fracciones en cada etapa de purificación de la columna. Además, realice una comparación lado a lado del control y la muestra de plasma para averiguar qué proteína se expresa de manera diferente.

Para terminar, me gustaría señalar que la electroforesis 2D le brinda un gel para comparar, como se muestra en la imagen, de todos modos. Así que podría ser una mejor solución a su problema. Sin embargo, admito que es posible que deba configurar la purificación para confirmar sus hallazgos.

¡Espero que ayude, buena suerte!