Estoy un poco confundido acerca de lo que significa la interrupción de genes específicos. Estaba leyendo este artículo en el que comparan el genoma de Pyrococcus Furiosus con una variante genéticamente tratable del genoma de P. Furiosus, llamada COM1. Cuando describen cómo se obtuvo la cepa COM1 dicen:
La cepa COM1 se obtuvo mediante la interrupción del gen dirigido del locus pyrF (PF1114) utilizando un plásmido diseñado para la recombinación de cruce doble (37).
Dado que la definición de Springer sobre la interrupción de genes específicos es simplemente:
El reemplazo experimental de un gen endógeno por una versión mutada (no funcional) dentro del genoma sin cambios se denomina alteración genética dirigida.
Llegué a la conclusión de que es el reemplazo del gen, que en este caso se llama pyrF, por parte del experimentador con una versión no funcional dentro del genoma de la variante genéticamente tratable de P. Furiosus. Así que pensé que era una especie de "desactivación" de un gen.
Luego, en esta discusión sobre ¿Cuál es la relación entre el genoma de una cepa "principal" y su genoma variante en arqueas? , alguien me sugirió amablemente que leyera el artículo original sobre cómo se descubrió la cepa COM1. Aquí encuentro algunas contradicciones con la idea que construí sobre la "disrupción genética dirigida del locus pyrF".
En este diario dicen que
En un intento de desarrollar un método para introducir ADN en Pyrococcus furiosus, descubrimos una variante dentro de la población de tipo salvaje que es naturalmente y eficientemente competente para la captación de ADN. Se construyó un mutante por deleción del gen pyrF en el genoma, y las frecuencias combinadas de transformación y recombinación de esta cepa permitieron el reemplazo del marcador por selección directa usando ADN lineal.
Entonces también eso:
no ha habido informes de manipulación genética del cromosoma de P. furiosus. Aquí usamos selecciones de simvastatina y 5-FOA para generar una cepa ΔpyrF, denominada COM1
Y, finalmente, otro extracto importante:
Aquí informamos la construcción de una deleción del locus pyrF en el cromosoma de P. furiosus y el descubrimiento de que esta cepa, denominada COM1, es notablemente eficiente y naturalmente competente para la captación de ADN circular y ADN lineal.
Debo decir que este artículo fue demasiado difícil para mí y lleno de detalles que no me interesan, por lo que no lo leí en profundidad, pero seleccioné estos extractos que describen en palabras simples cómo se obtuvo COM1. Sin embargo, de estos tengo una idea de cómo se obtiene COM1 que es diferente a la que pensé al principio por Springer.
Dado que la definición de Wikipedia de mutante por eliminación de genes es:
En genética, una deleción (también llamada deleción génica, deficiencia o mutación por deleción) (signo: Δ) es una mutación (una aberración genética) en la que una parte de un cromosoma o una secuencia de ADN se omite durante la replicación del ADN. Se puede eliminar cualquier cantidad de nucleótidos, desde una sola base hasta una parte completa del cromosoma.
Teniendo en cuenta este y los otros dos extractos que informé, ahora mi idea de cómo se obtuvo COM1 es que el pyrF fue eliminado (por los científicos) y esa parte fue (naturalmente) sustituida por un marcador (es decir, "una secuencia de ADN con un ubicación física conocida en un cromosoma") que es un ADN lineal ya que esta cepa COM1 es notablemente eficiente y naturalmente competente para la captación tanto de ADN circular como de ADN lineal.
Ahora mi pregunta es: ¿la definición de Springer (vinculada arriba) es "universal" o por la interrupción de un gen dirigido se puede intentar no solo la manipulación genética "artificial" sino también la eliminación de un gen y el reemplazo natural que también podría conducir a un nuevo gen pyrF ( en este caso) que es funcional (entonces no no funcional)? ¿Qué significa cuando digo "La cepa COM1 se obtuvo mediante la interrupción del gen dirigido del locus pyrF (PF1114)"?
Pido disculpas por la pregunta larga y le agradezco de antemano.
Tienes razón en su mayor parte, sin embargo, estás malinterpretando un poco lo que ha sucedido aquí.
La definición de Springer es correcta: una interrupción de un gen específico es un reemplazo directo del gen por uno no funcional. Sin embargo, para hacerlo, también necesita algún método para detectar que la interrupción de su gen funcionó y persistirá. Esto se hace más comúnmente introduciendo marcador(es) junto con el gen interrumpido en una forma conocida como casete .
En el caso que usted presenta, parece que han utilizado simvastatina como agente de selección y ácido 5-fluoroorótico (5-FOA) como indicador para mostrar que mientras el gen se ha alterado (es decir, no funcional), la expresión desde esa ubicación todavía está sucediendo como debería.
El método que utilizaron para introducir este casete es una recombinación entre un plásmido y el genoma de Pyrococcus . Este es (o era) un método común de alterar el genoma de muchos organismos para efectuar algún cambio funcional. El plásmido tendrá sitios que flanquean el casete que coinciden con el huésped (en este caso, el genoma de Pyrococcus ) y estos se utilizan para que el genoma se recombine de la manera descrita en las imágenes aquí .
Manuela