Extracción de ADN Pyura

Estoy luchando con la extracción de ADN genómico de diferentes muestras de Pyura chilensis ; el ADN se degrada como puede verse en el gel.

Siempre hemos utilizado el kit de purificación de ADN genómico GeneJET (de ThermoFisher), y funciona bien para muestras de otras especies; entonces el equipo no es el problema.

Siempre hemos utilizado muestras de tejido almacenadas en etanol al 95% (que se lavan con agua antes de la extracción de ADN), pero el problema persiste independientemente de si las muestras tienen un día o algunos años. El método de almacenamiento parece funcionar bien para la extracción de ADNg de otras especies.

Entonces, supongo que el problema está en Pyura. Así que tengo que averiguar si la extracción o el almacenamiento no son apropiados para Pyura. Leí que Pyura tiene mucho cobre. Planeamos usar un nuevo tampón para almacenarlo: DMSO saturado de sal, que contiene EDTA.

Me gustaría preguntar si alguno de ustedes ha trabajado alguna vez con este organismo (y si lo ha hecho, entonces cómo se las arregló para extraer el ADN de él). ¿Tiene alguna sugerencia sobre algún protocolo de purificación de ADN?

ingrese la descripción de la imagen aquíEl primer carril es la escalera (1kb) y los últimos 3 carriles con algo largo y borroso en lugar de bandas son mis muestras de ADN.

Respuestas (2)

Con referencia a su foto de gel, el ADN genómico (en los tres carriles de muestra de Pyura) no parece muy degradado. Si el marcador de tamaño es una escalera de 1 Kb, entonces la mayoría del ADN es de alto tamaño molecular. Durante la extracción, es común que el ADN de alto peso molecular se "corte" hasta cierto punto (se rompa mecánicamente en fragmentos más pequeños). Esto puede aparecer como una mancha hacia abajo tenue . Los carriles también pueden estar algo sobrecargados. Puede intentar usar una técnica de extracción más suave y ver si ayuda a su satisfacción. Cualquiera de los que mencionas funcionará.

El ADN genómico gravemente degradado aparecería como una "mancha" más intensa cerca de la porción inferior del estándar de tamaño de 1 Kb.

Esto es de un trabajo publicado por Segovia et al. 2017 :

Se usó tejido del manto (0,2 g) de cada individuo para extraer ADN utilizando el kit DNeasy Blood® & Tissue (QIAGEN®, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La cantidad/pureza del ADN se midió en Nanodrop 2000 (Thermo, EE. UU.).

Han hecho la identificación de SNP a partir del genoma. Así que asumo que su gDNA habría sido de una calidad decente.

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