En un experimento piloto, probé tres métodos diferentes de extracción de ADN genómico en el organismo no modelo Pieris mannii (pequeño blanco del sur; Insecta, Lepidoptera, Pieridae). El objetivo era generar fragmentos de ADN de ≥30 kpb de longitud promedio para la preparación de bibliotecas para la secuenciación de lectura larga (HiFi) PacBio SMRT).
Los tres métodos/kits utilizados fueron: kit de sangre y tejido de Qiagen (ensayo en columna), Beckman & Coulter DNadvance (kit de perlas magnéticas) y extracción estándar con fenol-cloroformo.
Los organismos criados en laboratorio en la etapa prepupal (terminación de la fase de crecimiento larvario, después de la última excreción del contenido intestinal, sin exoesqueleto quitinoso) se recolectaron y congelaron a -20°C. Para las extracciones de ADN, la cabeza y los dos primeros pares de patas (aprox. 20 mg) se cortaron y procesaron de acuerdo con los protocolos del kit/estándar con algunas modificaciones para ADN de alto peso molecular:
| Método | Promedio Rango de longitud de fragmentos de ADN (pb) | Gama A260/280** | Gama A260/230** | Promedio de nanogotas concentrado (ng/µl) | Qubit promedio concentrado (ng/µl) |
|---|---|---|---|---|---|
| Qiagen | 1038 - 18366 | 2.07 - 2.12 | 1,77 - 2,15 | 1151.8 | 104.9 |
| Cuentas magnéticas | 7350 - 12586 | 1,98 - 2,11 | 1,60 - 1,76 | 1048.7 | 155.8 |
| Fenol-cloroformo | 19552 - 27359 | 2.03 - 2.14 | 1,94 - 2,10 | 1389.2 | 215.4 |
*evaluado con Agilent Femto Pulse
**Resultados de Nanodrop
Los fragmentos de ADN parecen estar fuertemente cortados, las muestras contaminadas con compuestos orgánicos (especialmente los de perlas magnéticas) y la gran diferencia de concentración entre las mediciones de Nanodrop y Qubit pueden indicar contaminación por ARN.
¿Cómo se puede aumentar la longitud y la pureza de los fragmentos de ADN? ¿Cuáles son las medidas más importantes? ¿Qué etapa de la vida recomiendas usar?
Ideas:
Es difícil trabajar con muestras de insectos principalmente porque contienen una gran cantidad de polisacáridos, como quitinas , que son lo suficientemente similares a los ácidos nucleicos como para que puedan coprecipitar. Los procedimientos de extracción estándar (por ejemplo, los kits de sangre/tejidos de Qiagen) no manejan esto bien sin algunas modificaciones para deshacerse de estos contaminantes. El aspecto viscoso de sus extracciones es el resultado de estos contaminantes.
En mi época (hace más de 20 años), al manipular muestras de plantas, que tenían problemas similares con los polifenoles, las extracciones se realizaban con extracciones de fenol-cloroformo modificadas. La forma específica fue una extracción denominada PCI (fenol-cloroformo-alcohol isoamílico), con adición de B-mercaptoetanol y polivinilpirrolidona en tampón CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio).
Hice una búsqueda rápida de extracciones de ADN de insectos y descubrí que existen protocolos similares para insectos para secuencias de lectura largas (consulte la referencia 4 en el enlace). Parece que SDS con búfer CTAB es el camino a seguir, seguido de extracción de PC o PCI .
Además, la medición de las concentraciones de ADN y ARN mediante espectrometría (nano-gota, etc.) no es confiable: ese método es excelente para informarle sobre el ADN/ARN en soluciones de proteínas (el propósito original del método), pero en realidad no es lo suficientemente confiable para el ADN. / Cuantificación de ARN para la secuenciación Gen 3 (o Gen 2 para el caso).
En su lugar, haga lo que ha hecho, use un Qubit u otro método de fluorescencia para cuantificar y analizar sus muestras en un bioanalizador (Agilent) (electroforesis de alta velocidad, con métricas en la muestra agregadas durante el análisis).
Creo que la respuesta de @ bob1 es buena y cubre muchas de las bases.
Sin embargo, una cosa que creo que falta es el uso de una preparación nuclear como paso inicial; entiendo que esto puede ayudar con muchos de los problemas de contaminantes fenólicos/quitínicos en organismos difíciles como plantas/hongos/insectos. Aquí hay un protocolo sugerido .
También recomendaría verificar qué hay en protocols.io. Aquí hay un protocolo para la preparación de ADN de HMW de insectos , y aquí hay una discusión posiblemente relevante .
Maximiliano Prensa
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Roni Saiba