Probé varios genes domésticos: Hprt , β-actina y GAPDH , para analizar la expresión relativa de una citocina para medir la respuesta inflamatoria local en oídos de ratones. Sin embargo, todos estos genes domésticos muestran una variación significativa tanto dentro como entre diferentes condiciones experimentales.
Realmente no sé cómo resolver esto. Tomo la misma cantidad de ARN (cuantificado por nanodrop) para hacer ADNc, así que supongo que tengo la misma concentración en todas las muestras.
¿Alguna sugerencia de que puede pasar y como solucionarlo? ¿Podría usar algo diferente para medir la cuantificación relativa? (Mi citoquina de interés es TNF).
No dices cómo estás midiendo, pero supongo que estás usando PCR cuantitativa. Un enfoque típico para manejar la normalización de genes de limpieza en experimentos de qPCR se describe en
Describimos una estrategia robusta e innovadora para identificar los genes de control expresados de manera más estable en un conjunto dado de tejidos y para determinar la cantidad mínima de genes necesarios para calcular un factor de normalización confiable. Hemos evaluado diez genes domésticos de diferentes clases funcionales y de abundancia en varios tejidos humanos, y hemos demostrado que el uso convencional de un solo gen para la normalización conduce a errores relativamente grandes en una proporción significativa de las muestras analizadas. La media geométrica de múltiples genes domésticos cuidadosamente seleccionados se validó como un factor de normalización preciso mediante el análisis de datos de micromatrices disponibles públicamente.
Hay un paquete R llamado NormqPCR que implementa este enfoque (publicación aquí ).
Brevemente, el enfoque requería medir múltiples genes domésticos y eliminar de forma iterativa los que son más variables, terminando con dos genes que son menos variables en conjunto, y haciendo una especie de gen pseudo-administrador con el que normalizar sus otros genes.
Esto no convierte mágicamente los datos malos en datos buenos, pero ayuda a solucionar algunos problemas intrínsecos con los genes de limpieza.
Los genes domésticos no son necesariamente constantes. Otra forma de medir el cambio de expresión génica es RNA-seq. Normaliza los recuentos contra todo el transcriptoma en lugar de contra ciertos genes de mantenimiento.
Si no hubiera un protocolo sólido establecido, podría seguir a Eissa et al. 2017, Informes científicos . Enfrentaron el mismo problema en otro sistema modelo inflamatorio en ratones y delinearon una estrategia sobre cómo encontrar genes sólidos de limpieza (y luego escribieron una publicación sobre esto).
Encontrar un gen de referencia adecuado es complicado. Depende de su conocimiento previo sobre el sistema. Puede comenzar con la misma cantidad de ARN, pero los errores pueden acumular muchos otros pasos. Es por eso que usa un gen de referencia para minimizar el efecto de esos errores acumulados durante el procesamiento de la muestra. Entonces, a menos que sea muy preciso, no puede decir que todo fue constante y que la expresión es la fuente de variación. Una vez que prueba minuciosamente un gen de referencia putativo, puede "creer" que no cambiará cuando repita el experimento.
Habiendo dicho eso, insistiría en que un método mucho mejor (y bastante fácil) es usar un " pico de entrada ". Es un ácido nucleico sintético que agrega a sus muestras. También se puede utilizar un concepto similar para proteínas y metabolitos. Puede agregar las mismas cantidades de ARN sintético en sus diferentes muestras de ARN. Si mantiene el volumen constante, la concentración del suplemento sería la misma en diferentes muestras. Entonces, en lugar de un gen de limpieza, ahora usaría el complemento como referencia. Se ha encontrado que los picos son confiables incluso para estudios de RNAseq de una sola célula ( Lun et al., 2017 ).
Douglas Myers-Turnbull
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