¿Cómo se hicieron los primeros cebadores?

El químico sintético del MIT, Gobind Khorana, ganó el Premio Nobel de Química de 1968 por su trabajo, que logró crear cadenas de ácidos ribonucleicos. La química era difícil en ese momento, pero ganó el premio por hacer secuencias específicas de bases de ARN que luego se alimentaron a las células, lo que resultó en cadenas de aminoácidos específicas, que finalmente descifraron la base específica a la correspondencia de aminoácidos del código genético.

Khorana fue solo uno de los químicos que trabajó en la síntesis de nucleótidos , pero la técnica en general es simple y dado que los polímeros de ácido nucleico son solo polímeros no ramificados, cualquier combinación de secuencias se obtiene fácilmente. Cada reacción secuencial agrega una base. Repita la reacción tantas veces como sea necesario.

La química que ideó Khorana se perfeccionó y se extendió fácilmente a los polímeros de ADN ya que los enlaces son idénticos, la diferencia entre el ADN y el ARN es solo un único grupo de alcohol (-OH), que no está directamente involucrado en el enlace entre las bases de nucleótidos.

En 1983, cuando Kary Mullis concibió la idea de la PCR, se podían sintetizar secuencias cortas de ADN y ARN en máquinas disponibles comercialmente. De hecho, Mullis era responsable de una máquina de este tipo en Cetus Pharmaceuticals y había estado tratando de encontrar una manera de aumentar la demanda de sus servicios.

Los oligos de PCR fueron la parte fácil de la operación. Para probar el concepto, el equipo de Cetus usó una polimerasa de ADN convencional y la agregó a la mezcla de PCR después de cada ciclo. En 1986, el equipo de Cetus logró realizar una PCR con una polimerasa de ADN tolerante al calor de Thermus aquaticus, una bacteria de una fuente termal, lo que básicamente la convirtió en la técnica que todavía usamos hoy.

El proceso de secuenciación fue, y puede ser, asistido mediante la clonación de un fragmento de ADN en un sitio conocido en un plásmido diseñado para ayudar a la secuenciación. Ese sitio de clonación está flanqueado por una(s) secuencia(s) conocida(s) que puede(n) usar cebadores estándar

En la figura, "A" y "B" son solo puntos de referencia a cada lado del sitio de clonación. Por supuesto, el plásmido se extiende a ambos lados de la región mostrada. Primero se corta el plásmido en el sitio de clonación (paso superior) y se liga el fragmento de ADN desconocido (paso medio). Entonces se puede usar la secuencia "directa" conocida, con un cebador complementario (que se muestra como la flecha), para cebar una reacción de secuenciación (paso inferior, línea discontinua). Las modificaciones adicionales incluyen (por @Chris) preparar el inserto con adaptadores o usar un plásmido con secuencia que se une a un cebador 'inverso' (en esta figura, sería una flecha en el lado derecho de "B" y apuntando hacia la izquierda ). El cebador inverso permite la secuenciación de la hebra opuesta al cebador directo y da acceso al 3' final de la secuencia desconocida insertada. En los primeros días de la secuenciación de Sanger, las longitudes de lectura eran bastante cortas y, a menudo, no podían ejecutar la longitud de una inserción más grande.

Los plásmidos de secuenciación están diseñados de modo que es poco probable que sus sitios de unión de cebadores directos e inversos contengan secuencias que puedan encontrarse en el inserto. Debido a que estos cebadores conocidos se pueden usar de esta manera para secuenciar casi cualquier inserción, a menudo se les llama cebadores universales (según @AlanBoyd).